Acción de Células Madre de Líquido Amniótico sobre un Modelo de Enteritis Necrotizante

• AUTOR : Zani A, Cananzi M, De Coppi P y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Amniotic Fluid Stem Cells Improve Survival and Enhance Repair of Damaged Intestine in Necrotising Enterocolitis Via a COX-2 Dependent Mechanism
• CITA : Gut 0:1-10, 2013
• MICRO : La inyección de células madre de líquido amniótico mejora la supervivencia, la clínica, la estructura y la función del intestino en un modelo experimental de enteritis necrotizante, probablemente mediante efectos paracrinos de reducción de la inflamación y apoptosis, además de aumento de la proliferación y migración de enterocitos.

Introducción

La enterocolitis necrotizante (EN) representa hasta el 10% de las internaciones en las unidades de cuidados intensivos neonatales, y es una de las principales causas de morbimortalidad en recién nacidos. Si bien la leche materna, la arginina y los probióticos podrían reducir la incidencia de la enfermedad, no se conocen terapias médicas que sean clínicamente beneficiosas para niños con EN, y la resección quirúrgica de los segmentos afectados suele asociarse con insuficiencia intestinal o síndrome de intestino corto y, en consecuencia, con la dependencia de nutrición parenteral a largo plazo o necesidad de trasplante intestinal.

Las células madre son alternativas terapéuticas útiles para otras enfermedades intestinales, de las cuales algunas, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), tienen características similares a las de la EN. En 1993, se utilizó por primera vez el trasplante de células madre autólogas para mejorar un caso de enfermedad de Crohn, y luego se estudiaron en EII refractaria. En modelos experimentales se observó que las células de médula ósea tienen efectos antiinflamatorios, y posiblemente se diferencien en células epiteliales del tracto gastrointestinal y se integren en la mucosa, donde podrían ser capaces de reparar tejidos y formar vasos sanguíneos. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial uso de células madre en un modelo experimental de EN. Si bien en un primer momento los autores intentaron emplear células madre mesenquimatosas de médula ósea, la falta de efecto sobre la supervivencia los llevó a utilizar células de líquido amniótico (CLA), cuyo potencial de regeneración es mayor debido a su origen fetal.

Métodos

Se tomaron células madre de líquido amniótico y de médula ósea según protocolos ya establecidos, y se utilizaron mioblastos de músculo esquelético de rata como control. Se indujo EN en ratas recién nacidas mediante la nutrición enteral con fórmulas hiperosmolares, en condiciones de hipoxia y con administración oral de lipopolisacáridos y, tras 24 horas, se distribuyó aleatoriamente a los animales para que recibieran 2×106 células de líquido amniótico o médula ósea, o bien mioblastos, o sólo solución salina con fosfato o medio de cultivo, mediante inyección intraperitoneal. Se utilizó un grupo control adicional compuesto por ratas sanas que sólo recibieron lactancia materna. Se realizaron estudios de resonancia magnética (RM), pruebas de inmunohistoquímica para varias proteínas y pruebas de motilidad y permeabilidad intestinal. Tras sacrificar algunos animales a las 96 horas del estudio, se realizó biología molecular del intestino, estudio de la inflamación por marcadores de peroxidación de lípidos y medición de infiltración de neutrófilos y evaluación del índice de apoptosis. Se estudió también la migración y proliferación de enterocitos y el efecto de tres inhibidores de la ciclooxigenasa (COX): sc-560, ibuprofeno y celecoxib, en comparación con sólo vehículo, administrados por nutrición enteral a las 24 horas de vida. Para el análisis estadístico, se compararon las curvas de supervivencia mediante la prueba de Mantel-Cox y se realizaron pruebas de Mann-Whitney, ANOVA y Fisher; se consideraron significativos valores de p < 0.05.

Resultados

La administración intraperitoneal de células madre de médula ósea a las 24 y 48 horas no se asoció con una mejoría en la supervivencia de ratas con EN, en comparación con aquellos animales que recibieron solución salina. La supervivencia de las ratas que recibieron lactancia y no sufrieron EN fue de 92%. Se observó que, en las ratas con esta enfermedad a las que se inyectó CLA, la supervivencia era significativamente mayor tras siete días, en comparación con los otros grupos con EN y, tras 96 horas de tratamiento, el estado clínico era mejor. La acumulación de líquido peritoneal fue significativamente mayor en las ratas con EN que recibieron sólo solución salina, en comparación con las que recibieron CLA o células de médula ósea y, en las primeras, a diferencia de los otros grupos con EN, se observó dilatación de asas intestinales y menor grosor de la pared intestinal. Se demostró una mejoría clínica tras el tratamiento con CLA en cuanto a la función intestinal, y la motilidad se mantuvo, a diferencia de las ratas que recibieron solución salina, en las que se redujo considerablemente en comparación con las ratas sanas del grupo control. No se observaron diferencias significativas en cuanto al peso y la longitud intestinal entre los grupos, pero el marcador de tránsito intestinal logró atravesar este órgano en 75% de las ratas sanas del grupo control, 19% de las que sufrieron EN y recibieron solución salina y 47% de las tratadas con CLA. En estas últimas se detectaron contracciones espontáneas similares al peristaltismo normal, y el aumento de permeabilidad intestinal fue parcialmente evitado en este grupo, a diferencia de las ratas que recibieron solución salina, en las que la permeabilidad fue significativamente mayor.

A las 96 horas, la apariencia macroscópica del intestino de las ratas tratadas con CLA fue similar a la de las ratas sanas del grupo control, con significativamente menor daño (desprendimiento de vellosidades, separación de la base y congestión venosa) y necrosis que las que recibieron solución salina. Los autores postulan que los resultados positivos en cuanto a supervivencia, clínica, función intestinal e histología en los animales que recibieron CLA podrían ser explicados por migración de estas células e integración con el intestino dañado, y demostraron que las CLA se adherían al mesenterio tras 48 horas, se ubicaban en la serosa y la capa muscular a las 72 horas y, tras 96 horas, se detectaron algunas de estas células en las vellosidades, con expresión de músculo liso y, en ocasiones, la formación de anillos alrededor del intestino. Se observó, además, que, en las ratas que recibieron CLA, el intestino siempre presentaba un marcador de estas células, mientras que se observaba un marcador en el hígado en 32% de los animales; en los riñones, en 21%; en el bazo, en 20%; en el corazón, en 17%; y, en los pulmones, en 15%, y no se observó el marcador en el cerebro o la médula ósea. En la mitad de estas ratas, únicamente se detectó el marcador en el intestino.

Si bien el beneficio de las CLA parece depender de su presencia en el intestino, el bajo nivel de prendimiento de estas células fue sugerente de una acción paracrina. Esto se comprobó cuando al día de vida se inyectó medio condicionado, CLA, solución salina o medio esencial mínimo alfa (MEMA) en un grupo de ratas, y se observó que la supervivencia era significativamente mayor en las que recibieron medio condicionado o CLA (sin diferencia entre estos grupos) en comparación con las que recibieron solución salina (p < 0.01 y p < 0.001, respectivamente) o MEMA (p < 0.0001 para ambos grupos). Se identificaron 37 genes cuya expresión era diferente en los distintos grupos, y la mayoría se asociaba con inflamación, reparación de tejidos, regulación del ciclo celular y diferenciación de enterocitos. En las ratas tratadas con CLA, se observó una menor peroxidación de lípidos e infiltración de neutrófilos, mayor migración de enterocitos desde las criptas y menor apoptosis, en comparación con las ratas que recibieron solución salina (12% de células positivas para apoptosis contra 45%, respectivamente, p < 0.05).

En las ratas tratadas con CLA y los controles sanos, se observaron células positivas para COX-2 en la lámina propia, pero éstas estaban considerablemente disminuidas en las ratas que recibieron solución salina, y en el primer grupo se detectaron más células de este tipo en las criptas en comparación con los otros dos grupos. Se observó una correlación inversa entre el número de células positivas para COX-2 por cada vellosidad y en las criptas y el grado de daño intestinal. En cuanto al efecto de la inhibición de COX-2, se detectó que la supervivencia y la clínica de las ratas tratadas con CLA que recibieron vehículo eran significativamente mayores que las de las ratas que recibieron solución salina y vehículo, y que el efecto beneficioso de las CLA era eliminado al agregar inhibidores selectivos o no de la COX-2, pero no al agregar inhibidores selectivos de COX-1. Los inhibidores de COX-2 no modificaron la supervivencia de las ratas sanas de control ni la de las que recibieron solución salina.

Discusión

El presente estudio demostró, por primera vez, que la inyección de CLA mejora en forma significativa la supervivencia de ratas con EN. A diferencia de otras enfermedades, no se detectó un efecto beneficioso del uso de células de médula ósea, posiblemente por diferencias en la patogénesis, dado que la EN se asocia con isquemia e inmadurez intestinal, mientras que en la EII existe principalmente alteración en la regulación inmune. Además del efecto sobre la supervivencia, se demostraron efectos beneficiosos de las CLA sobre otros parámetros en ratas con EN, como mejoría clínica (indicador de gravedad del daño sobre el intestino, tanto macroscópico como microscópico, y demostrado mediante RM), mayor motilidad intestinal y recuperación de la permeabilidad intestinal. En ratas tratadas con CLA, no se observaron las alteraciones de las vellosidades típicamente asociadas con EN, y el efecto beneficioso se relacionó con la presencia de estas células en el intestino, entre 48 y 72 horas luego de su administración intraperitoneal. Los autores postulan que este efecto parece depender de un mecanismo paracrino, por liberación de factores de crecimiento específicos por parte de las células madre que actúan sobre células progenitoras residentes, mediante la acción sobre distintas vías y genes relacionados con la inflamación tisular (con reducción de peroxidación de lípidos e infiltración de neutrófilos), la apoptosis (especialmente en las criptas) y la proliferación celular. Se observó que las CLA activan específicamente células que expresan COX-2, que promueven proliferación epitelial y migración, a la vez que evitan la apoptosis.

Conclusión

Los autores aseguran que la inyección de CLA mejora la supervivencia, la clínica y la estructura y función del intestino en un modelo de EN, probablemente mediante efectos paracrinos de reducción de la inflamación y apoptosis, además del aumento de la proliferación y migración de enterocitos, lo que ayuda a la restitución del epitelio. Estos efectos parecen depender de la acción de células que expresan COX-2, y el efecto puede ser eliminado al administrar inhibidores de esta enzima.

Ref : GASTRO.

Especialidad: Bibliografía - Gastroenterología