Efectos de la Genipina sobre la Diferenciación de los Osteoclastos

• AUTOR : Hoon Lee C, Kwak S, Oh J y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Genipin Inhibits RANKL-Induced Osteoclast Differentiation through Proteasome-Mediated Degradation of c-Fos Protein and Suppression of NF-kB Activation
• CITA : Journal of Pharmacological Sciences 124(3): 344-353, Mar 2014
• MICRO : Los hallazgos en conjunto sugieren que la genipina de Gardenia jasminoides reduce la diferenciación de los osteoclastos, mediada por el RANKL, al inducir la degradación de c-Fos, mediada por proteasomas, y al suprimir la activación del factor nuclear NF-kB.

Introducción

Los trastornos de la arquitectura ósea y el aumento del riesgo de fracturas son complicaciones características de la osteoporosis, una enfermedad cada vez más frecuente, en relación con el incremento de la población de edad avanzada. Las fracturas de cadera, en particular, se asocian con un deterioro funcional significativo y con mayor riesgo de mortalidad. En este contexto, el tratamiento adecuado de la osteoporosis posmenopáusica y de la osteoporosis secundaria al uso prolongado de esteroides (por ejemplo en los pacientes con artritis reumatoidea y enfermedad pulmonar obstructiva crónica) asume un papel decisivo.

En condiciones fisiológicas, la función de los osteoblastos y los osteoclastos se encuentra equilibrada; la mayor actividad de estos últimos se asocia con pérdida de masa ósea. De hecho, casi todos los fármacos que se utilizan en la actualidad para el tratamiento de la osteoporosis tienen por objetivo suprimir la resorción ósea, mediada por los osteoclastos.

Los osteoclastos, recuerdan los autores, son células que derivan de precursores hematopoyéticos, del linaje de monocitos y macrófagos; los osteoblastos, en cambio, derivan de células progenitoras mesenquimáticas. La interacción entre el ligando del receptor activador del factor nuclear NF-kB (RANKL), presente en la superficie de las células osteoblásticas y el RANK, expresado en los osteoclastos, representa el primer paso en la diferenciación de los osteoclastos.

El RANKL es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) que ejerce un papel decisivo en la regulación de la función de los osteoclastos, al inducir la transcripción de ciertos factores, tales como el NF-kB, c-Fos y el factor nuclear activado de las células T(nuclear factor of activated T cells [NFAT]) c1. Este último interviene en forma importante en la diferenciación de los osteoclastos.

Los bisfosfonatos son los fármacos más utilizados para el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica y de la osteoporosis asociada con los corticoides; los bisfosfonatos se unen a la hidroxiapatita en el tejido óseo, inhiben la actividad de los osteoclastos y, por ende, motivan su apoptosis. Si bien estos fármacos son muy eficaces, los efectos adversos (esofagitis y necrosis mandibular) a menudo complican la continuidad del tratamiento.

La genipina es un genipósido derivado de la gardenia utilizado desde hace tiempo en la medicina oriental; diversos trabajos recientes confirmaron sus efectos antimicrobianos, antitumorales y antiinflamatorios. Asimismo, la genipina facilita la proliferación, diferenciación y maduración de las células similares a los osteoblastos. Hasta ahora, sin embargo, el papel de la genipina sobre la diferenciación de los osteoclastos, mediada por el RANKL, no ha sido investigado. El presente trabajo tuvo por objetivo analizar este aspecto.

Materiales y métodos

El genipósido y la genipina de Gardenia jasminoides se obtuvieron mediante cromatografía en columna de sílica gel e hidrólisis con beta glucosidasa, respectivamente. Para los experimentos se utilizaron ratones macho de cinco semanas de vida. Las células de la médula ósea se obtuvieron del fémur y la tibia; se separaron los macrófagos derivados de la médula ósea (MMO) y se cultivaron en medios apropiados, en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-SCF, por sus siglas en inglés) y RANKL. Los osteoclastos se identificaron por la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (tartrate-resistant acid phosphatase [TRAP]).

En los ensayos de citotoxicidad, los MMO se incubaron con M-CSF (30 ng/ml) y con concentraciones crecientes de genipina. Luego de tres días se agregó el reactivo XTT. Mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR, por sus siglas en inglés) se determinó la expresión de ARN mensajero (ARNm) de c-Fos, NFATc1, TRAP y OSCAR. El lisado de las células se analizó con inmunoelectrotransferencia y electroforesis en gel de poliacrilamida para conocer la expresión de las proteínas correspondientes.

Los osteoclastos y los osteoblastos maduros se obtuvieron de las células de la médula ósea; se mantuvieron en cultivo con 1,25-hidroxivitamina D3 y prostaglandina E2. Las células se incubaron en presencia o ausencia de genipina. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Las comparaciones estadísticas se realizaron con pruebas de la t y modelos ANOVA.

Resultados

En un primer paso se evaluaron los efectos de la genipina sobre la osteoclastogénesis, para lo cual los MMO se trataron con genipina, en presencia de RANKL y M-CSF. Los MMO del grupo control se diferenciaron en osteoclastos multinucleados maduros, TRAP positivos; la formación y el número de osteoclastos TRAP positivos disminuyeron en relación con la presencia y la concentración de genipina en los cultivos. Con la finalidad de conocer la temporalidad del efecto, los MMO fueron expuestos a la genipina en varios momentos, luego de la estimulación con RANKL. En estos experimentos, el efecto inhibitorio de la genipina sólo tuvo lugar poco después de que los MMO fuesen estimulados con el RANKL. De hecho, la acción inhibitoria desapareció cuando la genipina se agregó a los cultivos, tres días después del tratamiento con RANKL. El ensayo con XTT confirmó que la genipina, en las dosis que inducen la supresión de la diferenciación de osteoclastos, no se asocia con efectos citotóxicos.

Los autores recuerdan que el RANKL activa diversas señales intracelulares involucradas en la osteoclastogénesis, por ejemplo p38, ERK, JNK, Akt y NF-kB, importantes factores de transcripción en la diferenciación de los osteoclastos.

Cuando los precursores de los osteoclastos fueron tratados con genipina durante una hora, y luego estimulados con RANKL, la inducción de la fosforilación de p38, ERK, JNK y Akt mediada por el RANKL no estuvo afectada por el pretratamiento con genipina. Por el contrario, la degradación de IkB se redujo en forma significativa y proporcional a la dosis de genipina. Igualmente, la fosforilación de IkB se suprimió.

Los factores c-Fos y NFATc1 influyen en la diferenciación de los osteoclastos y regulan la expresión de genes específicos de estas células, por ejemplo OSCAR y TRAP. Por lo tanto, se analizaron los efectos de la genipina sobre la expresión de ARNm de c-Fos, NFATc1, OSCAR y TRAPen el contexto de la osteoclastogénesis inducida por RANKL. La expresión de ARNm de NFATc1, TRAP y OSCAR se inhibió significativamente en presencia de genipina; en cambio, la expresión de ARNm de c-Fos no se modificó. La expresión de la proteína NFATc1 aumentó en respuesta a la estimulación con RANKL; el efecto se suprimió en presencia de genipina.

De manera llamativa se comprobó que la expresión de la proteína c-Fos inducida por el RANKL se inhibió sustancialmente en los cultivos con genipina, a pesar de que la expresión de ARNm no se comprometió. Por lo tanto, se evaluaron los efectos de la genipina sobre el ARNm y sobre la degradación de la proteína, mediada por proteasomas. De esta forma se constató que la menor expresión de la proteína c-Fos obedeció a la mayor degradación: la inhibición se revirtió en presencia de MG-132, un inhibidor selectivo del proteasoma 26S. Estos hallazgos indican que la activación de la degradación mediada por proteasomas sería responsable de los efectos de la genipina sobre la expresión de la proteína c-Fos.

En un paso posterior, los investigadores trabajaron con MMO que presentaban expresión exagerada de c-Fos (mediante el uso de un vector retroviral). Los efectos inhibitorios de la genipina revirtieron parcialmente en presencia de una mayor expresión de c-Fos y CA-NFATc1. Los resultados en conjunto sugieren que la genipina suprime la osteoclastogénesis mediada por el RANKL en los MMO, mediante la inhibición de la expresión de c-Fos y NFATc1.

Finalmente, se analizaron los efectos de la genipina sobre la función de los osteoclastos. Para ello, los osteoclastos maduros se cultivaron en pocillos cubiertos con hidroxiapatita. Luego de 12 horas se comprobaron numerosas zonas de resorción. La genipina inhibió la resorción ósea en relación con la dosis.

Discusión

La genipina es una aglicona derivada del genipósido de Gardenia jasminoides. Debido a su capacidad natural de entrecruzamiento con proteínas, colágeno, gelatina y chitosán, la genipina tiene numerosas aplicaciones biomédicas, por ejemplo en los materiales para injertos, en los trasplantes de córnea y como sistema de liberación de fármacos, entre otras. Diversos estudios experimentales demostraron que la genipina ejerce efectos antiinflamatorios.

En la presente ocasión se analizaron los efectos de la genipina sobre la osteoclastogénesis inducida por el RANKL, por la posibilidad de su uso para el tratamiento de la osteoporosis. Se comprobó que la genipina inhibe las etapas tempranas de la osteoclastogénesis mediada por el RANKL, sin efectos citotóxicos.

Los autores recuerdan que la interacción entre el RANKL y sus receptores se asocia con la activación de distintos sistemas de señalización intracelular que culminan con la expresión de diversos genes relacionados con la osteoclastogénsis, tales como el c-Fos, NFATc1, OSCAR yTRAP. En el estudio, las vías dependientes de la JNK, p38 MAPK y Akt no estuvieron afectadas por la genipina. Sin embargo, la genipina inhibió la fosforilación de IkB y la activación del factor NK-kB (un factor de transcripción que cumple una función decisiva en la diferenciación de los osteoclastos).

El IkB se encuentra unido al NF-kB y, de esta forma, evita que el último pase al núcleo de las células. La fosforilación de IkB mediante la quinasa específica (IKK) motiva la separación de las dos proteínas; la degradación posterior de IkB por la vía de la ubiquitina-proteasomas permite que el NF-kB migre al núcleo celular y active genes específicos. Los resultados del presente estudio confirmaron la activación de NF-kB en los precursores de las células osteoclásticas mediante la activación y degradación de la IKK. La activación de la IKK inducida por el RANKL se suprimió en presencia de genipina; el resultado final fue la supresión de la activación del NF-kB.

Los factores de transcripción c-Fos y NFATc1 cumplen una función esencial en la osteoclastogénesis inducida por el RANKL. El RANKL induce la unión de c-Fos al promotor de NFATc1 y la expresión de NFATc1.

La genipina inhibió considerablemente la expresión de las proteínas c-Fos y NFATc1, asociada con el RANKL; sin embargo no afectó la expresión de ARNm de c-Fos. La proteína c-Fos tiene una vida media corta, es inestable y es degradada por proteasomas. En los experimentos en los cuales las células se incubaron con cicloheximida (un inhibidor de la síntesis proteica) o MG-132 (un inhibidor selectivo del proteasoma 26S) se confirmó que la inhibición de la expresión de c-Fos obedeció a su mayor degradación. Los resultados en conjunto sugieren que la genipina inhibe la osteoclastogénesis, al modificar la estabilidad de la proteína c-Fos, al inducir su degradación por proteasomas.

En los estudios previos con ratas, el tratamiento con genipina por vía oral se asoció con índices de mortalidad del 78%; asimismo, el uso prolongado de genipina y genipósidos indujo esclerosis de las venas mesentéricas. Estos efectos podrían limitar la aplicabilidad clínica de la genipina pero, sin duda, se requieren más estudios al respecto.

Conclusión

Los resultados en conjunto sugieren que la genipina de G. jasminoides inhibe la diferenciación de los osteoclastos al inhibir la activación de NF-kB y al inducir la degradación de c-Fos. Estas observaciones sugieren que la genipina podría tener algún papel para el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica y de la pérdida de masa ósea que tiene lugar en ciertos trastornos inflamatorios, por ejemplo en la artritis reumatoidea y en la periodontitis.

Ref : ENDO, GINECO.

Especialidad: Bibliografía - Endocrinología - Ginecología