Evalúan los Efectos del Omeprazol sobre las Células Neoplásicas Pancreáticas

• AUTOR : Udelnow A, Kreyes A, Würl P y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : OmeprazoleInhibitsProliferation and ModulatesAutophagy in PancreaticCancerCells
• CITA : PLosOne 6(5)May 2011
• MICRO : Se ha observado que la inhibición de la bomba de protones podría sensibilizar a las células frente al tratamiento citotóxico. También, se ha destacado el papel de la formación de especies reactivas del oxígeno entre los efectos celulares mediados por omeprazol.

Introducción

A pesar de los progresos respecto del diagnóstico y el tratamiento del carcinoma pancreático, las tasas de supervivencia siguen siendo bajas. Las células neoplásicas pancreáticas son altamente resistentes a las estrategias terapéuticas habituales. Existen varios mecanismos mediante los cuales estas células son capaces de resistir la apoptosis, como la regulación por diminución (en menos, down-regulation) de proteínas apoptóticas, la activación de quinasas, el aumento en la expresión de varios micro ARN, la mutación de la p53 y el polimorfismo de la MDM2. La identificación de sustancias capaces de revertir estos mecanismos resultaría de gran valor.

Recientemente, se ha observado que el omeprazol (OMP), fármaco que constituye el tratamiento estándar de la gastritis y de la úlcera duodenal desde 1980, posee efecto antiproliferativo y modulador de la resistencia, tanto in vivo como in vitro. Entre los mecanismos de acción propuestos, se cree que la inhibición de la bomba de protones podría sensibilizar la célula frente al tratamiento citotóxico. También, se ha destacado el papel de la formación de especies reactivas del oxígeno en los efectos celulares mediados por OMP. Todos estos mecanismos involucran al sistema de transporte lisosomal.

Estudios previos señalan que el OMP es un fármaco con un amplio rango terapéutico y con un buen perfil de tolerabilidad, aun a altas dosis, a diferencia de otros moduladores de la resistencia como el verapamilo o la bafilomicina.

Uno de los principales objetivos del presente estudio es determinar la eficacia del OMP en líneas celulares pancreáticas; para ello, los autores investigaron la relación dosis-efecto del OMP solo o en combinación con 5-fluorouracilo (5-FU) o gemcitabina (GEM) en estas líneas celulares, in vitro.

Materiales y métodos

Se cultivaron las líneas de células pancreáticas humanas MiaPaCa-2 y ASPC-1 y los anticuerpos Catepsina D, Lamp-1, beta-COP, Bad, Puma, Atg 12, LC3 y actina.

Se estudiaron los cambios moleculares y subcelulares en las líneas tratadas con OMP, con microscopio electrónico de transmisión y espectroscopía de RMN.

La determinación de las IC50 de cada droga se calculó utilizando el modelo log-logístico del paquete estadístico R.

La microscopía fluorescente con naranja de acridina se utilizó para analizar los cambios de pH intralisosomal tras el tratamiento con OMP y 5-FU, solos o combinados.

Se realizó análisis mediante la técnica de Western blot para detectar los cambios en la expresión de LC3.

Resultados

El OMP inhibe la proliferación celular pancreática de manera dependiente de la dosis y potencia los efectos citostáticos de la GEM y el 5-FU.

Para evaluar la aplicabilidad clínica del OMP, se determinó la IC50 del OMP, del pantoprazol (PZL), de la GEM y del 5-FU. Los valores fueron de 9 a 42 µg/ml, 22 a 99 µg/ml, 0.004 a 0.24 µg/ml y de 0.20 a 0.57 µg/ml, respectivamente.

A bajas dosis de la sustancia, el recuento celular fue mayor que en el grupo control, un fenómeno que se denomina «hormesis» y consiste en una respuesta sobrecompensatoria de los organismos vivos a situaciones estresantes, y que podría justificar la resistencia a la quimioterapia. La relación entre la dosis y el efecto fue variable en los distintos tipos celulares. En las líneas celulares ASPC-1, Panc-1 y Panc 89, el tratamiento combinado de OMP y 5-FU o GEM reveló interacciones dependientes de las dosis de tipo aditivas y una mitigación de la hormesis con dosis bajas de 5-FU.

La tinción con naranja de acridina permitió observar, con microscopía fluorescente, que a los 30 minutos de tratamiento, se registró un aumento de la acidez lisosomal, que fue disminuyendo gradualmente, después de 24 horas. Sin embargo, este efecto no fue específico del OMP, ya que, en las células ASPC-1 tratadas, la acidez intralisosomal aumentó levemente a las 24 horas.

Respecto de la inhibición de la autofagia, se observó que el tratamiento con 80 µg/ml de OMP se asoció con la aparición de fagóforos que contenían material citoplasmático y autofagosomas. Luego de la administración de 160 µg/ml de OMP, las células ASPC-1 entraron en apoptosis. Se observaron cambios similares en otras líneas celulares tratadas con 80 µg/ml de OMP.

Por lo tanto, el OMP produce la acumulación de marcadores de los estadios tempranos de la autofagia en todas las líneas celulares.

Para identificar los cambios metabólicos vinculados con los procesos previamente descriptos, se realizó espectroscopía de RMN en ambas líneas celulares y se observó que los marcadores del metabolismo de ácidos grasos y fosfolípidos sufrieron modificaciones tras el uso de OMP en ambas líneas celulares, pero principalmente en las MiaPaCa-2. Sin embargo, estos cambios no se limitaron a las células tratadas con OMP, sino que también aparecieron en presencia del 5-FU. Por lo tanto, no es un efecto específico del OMP.

Para determinar la actividad autofágica y detectar cambios en la expresión del gen LC3, se realizaron análisis con Western blot. El uso de OMP produjo una considerable elevación dependiente de la dosis de ambas fracciones del LC3, en ambas líneas celulares, lo que indica su capacidad para inducir la autofagia y disminuir el recambio celular. El 5-FU no influyó de modo relevante en la actividad autofágica.

Cambios genéticos en las células tratadas

Se analizó la expresión de los genes proapoptóticos y antiapoptóticos, y de los genes de las proteínas de membrana, ya que el mecanismo mediante el cual el OMP ejerce su efecto antiproliferativo, aún no se ha aclarado.

El ARNm del gen proapoptótico Bad se encuentra aumentado en las células tratadas con 5-FU + OMP, y suprimido en las tratadas sólo con OMP. El ARNm del Bcl-2 se encontraba disminuido por el 5-FU, pero no por el OMP o el OMP+F-FU. Por lo tanto, el 5-FU induciría la apoptosis y no la autofagia.

La expresión del gen antiapoptótico bcl-xl disminuyó significativamente en las células tratadas con 5-FU+OMP, mientras que el mdr-1, que codifica proteínas de membrana, se vio sobreexpresado en las células tratadas con OMP.

La survivina es un gen que promueve la progresión de las neoplasias y su supervivencia. Su supresión es uno de los requisitos para que un tratamiento quimioterapéutico resulte exitoso. En células tratadas con OMP, su expresión se vio suprimida.

Por lo tanto, el aumento de la expresión del gen mdr-1 y la supresión de la survivina fueron los cambios genéticos más específicos observados en el tratamiento con OMP.

El análisis de Western blot también reveló que el atg12, otro marcador específico de la autofagia, se encontró fuertemente activado en ambas líneas celulares tratadas con OMP.

Discusión

Estudios in vitro previos demostraron que las dosis gastroprotectoras de OMP (20 mg) no son suficientes para que el fármaco ejerza su acción antitumoral, en el cáncer pancreático, ya que se necesitan concentraciones plasmáticas mayores de 30 µg/ml. Los autores del estudio plantean la hipótesis de que dichas concentraciones, y aun concentraciones mayores, podrían ser bien toleradas.

El OMP es una prodroga cuya activación en el medio ácido bloquea la bomba de protones en las células parietales gástricas. Recientemente, se ha discutido el impacto del medio ácido sobre el potencial antiproliferativo del OMP. En el presente estudio, se utilizó un pH de 7.4, ya que el medio ácido puede influir sobre la actividad metabólica de las células tumorales. Sin embargo, un microambiente ácido de un tumor sólido o un medio de cultivo potencian la activación del OMP y sus propiedades farmacodinámicas.

Los ensayos de interacciones farmacodinámicas confirmaron que los efectos citostáticos del 5-FU y de la GEM se vieron potenciados por el OMP, de manera dependiente de la dosis en las células MiaPaCa-2. En cambio, en las células ASPC-1, se observó un efecto estimulador de la hormesis del 5-FU, a concentraciones plasmáticas por debajo de la IC50. El OMP revirtió este fenómeno en todas las líneas celulares, por lo que puede contribuir a la superación de la resistencia tumoral al tratamiento quimioterapéutico. La GEM no reveló efectos horméticos.

La microscopía electrónica se utilizó para evaluar los cambios morfológicos subcelulares. Se observó la acumulación de fagóforos y autofagosomas a concentraciones plasmáticas de 80 µg/ml. Cuando las concentraciones alcanzaron los 160 µg/ml, se observaron fenómenos de apoptosis en las células ASPC-1, mientras que, en las MiaPaCa-2, se encontraron signos de apoptosis ya a concentraciones menores. Si bien la autofagia se asocia con la muerte celular programada en las células resistentes a la apoptosis tras el tratamiento quimioterapéutico, también ha sido descripto como un mecanismo de supervivencia de las células malignas. Sin embargo, los autores del estudio consideran que la acumulación de marcadores tempranos de la autofagia tras el tratamiento con OMP refleja no sólo la inducción de la autofagia, sino también las alteraciones provocadas a nivel del transporte lisosomal, lo que interfiere con la función de supervivencia de la autofagia.

La cuantificación de ARNm reveló el aumento en la expresión de genes proapoptóticos y la disminución de genes antiapoptóticos a las 24 horas de tratamiento con 5-FU o 5-FU+OMP.

Conclusión

Los autores concluyen señalando que el OMP inhibe la proliferación de células neoplásicas mediante el mecanismo autofágico intrínseco de estas células, a través de la activación de mecanismos de transporte transmembrana y de la interrupción del transporte lisosomal. Los cambios bioquímicos causados por el OMP y el 5-FU pueden ser resumidos como cambios del metabolismo fosfolipídico y de la membrana, que sugieren la activación de la muerte celular programada. La modulación de la autofagia permite superar los mecanismos de resistencia antiapoptóticos que caracterizan a algunas células neoplásicas. Estos hallazgos permitirán diseñar nuevas estrategias terapéuticas en el manejo del carcinoma pancreático.

Ref : GASTRO, ONCO, ULCOZOL.

Especialidad: Bibliografía - Gastroenterología - Oncología