Efectos del Ácido Valproico en un Modelo Murino de Enfermedad de Alzheimer

• TITULO : Efectos del Ácido Valproico en un Modelo Murino de Enfermedad de Alzheimer
• AUTOR : Long Z, Zhao L, He G y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Valproic Acid Modifies Synaptic Structure and Accelerates Neurite Outgrowth Via the Glycogen Synthase Kinase-3Beta Signaling Pathway in an Alzheimer’s Disease Model
• CITA : CNS Neuroscience & Therapeutics 21(11): 887-897, Nov 2015
• MICRO : En ratones transgénicos, el tratamiento con ácido valproico mejora los trastornos del comportamiento, modifica la estructura de las sinapsis y acelera el crecimiento de los axones, mediante la inhibición de la actividad de la GSK-3-beta; la menor hiperfosforilación de la proteína tau es uno de los efectos finales.

Introducción 

La prevalencia de la enfermedad de Alzheimer (EA), un trastorno neurodegenerativo irreversible, es elevada. El deterioro cognitivo progresivo, los trastornos de la memoria y las alteraciones del comportamiento son los síntomas que caracterizan la EA. En los pacientes con EA se produce una reducción del tamaño de las regiones cerebrales involucradas en el aprendizaje y la memoria, como consecuencia de la pérdida de sinapsis y neuronas. En el estudio histopatológico se comprueban placas seniles (PS) extracelulares formadas por amiloide beta (Ab) y redes intracelulares neurofibrilares, con proteína tau hiperfosforilada. El Ab se forma por la fragmentación proteolítica de la proteína precursora de amiloide (PPA), en tanto que la hiperfosforilación de la proteína tau obedece a anormalidades en diversas quinasas, como la glucógeno sintasa quinasa 3-beta (GSK-3b, por su sigla en inglés); la anormalidad puede comprometer el transporte de los axones.

En los ratones transgénicos con expresión de PPA y presenilina 1 (PS 1), el depósito de Ab se observa a partir de la octava semana de vida, mientras que las PS se desarrollan a partir de los tres a cuatro meses. Luego del depósito cerebral de Ab se comprueba proteína tau hiperfosforilada.

Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes en la EA no se conocen por completo; en consecuencia, por el momento no se dispone de tratamientos curativos. Se considera que la acumulación de Ab es un trastorno esencial, ya que desencadena una serie de eventos neuropatológicos, responsables de la hiperfosforilación de la proteína tau, la disfunción sináptica y la muerte de las neuronas. Incluso así, los mecanismos que intervienen en el deterioro cognitivo asociado con la producción excesiva de Ab todavía no se comprenden por completo. En este escenario, el conocimiento de las vías de señalización involucradas en la fisiopatogenia de la EA permitiría diseñar estrategias terapéuticas destinadas a evitar o curar esta forma de demencia.

Según los resultados de un estudio, la GSK-3b tendría un papel decisivo en la EA; la activación anormal de esta quinasa se vincula con la formación de redes neurofibrilares. Además de ser la principal vía involucrada en la hiperfosforilación de la proteína tau, la GSK-3b también interviene en el procesamiento de la PPA y ejerce un papel importante en la plasticidad sináptica y la memoria. La GSK-3b inhibe la expresión de factores de transcripción, como la catenina beta y la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico (cAMP response element-binding protein [CREB]). El resultado final es la apoptosis neuronal y el compromiso de la plasticidad neuronal. En este contexto, los inhibidores de la GSK-3b han suscitado gran interés, como posible blanco terapéutico en los pacientes con EA.

El ácido valproico (AV) es un estabilizador del estado de ánimo, ampliamente utilizado como agente anticonvulsivo. El AV también ejerce efectos neuroprotectores, al estimular la liberación de factor neurotrófico y mediante la regulación de la actividad del GSK-3b. En un estudio previo, realizado por los autores, el AV disminuyó la producción de Ab y la formación de PS; sin embargo, los efectos del AV sobre otros procesos posiblemente involucrados en la EA no se conocen. Por lo tanto, en el presente estudio se analizaron los efectos del tratamiento con AV durante cuatro semanas en un modelo murino doble transgénico de EA, con expresión de PPA y PS 1.

Materiales y Métodos

Se utilizaron ratones transgénicos, B6C3-Tg, con expresión exagerada de PPA murina/humana y la variable humana mutante PS1-Δ9. El genotipo se conociσ mediante reacciσn en cadena de polimerasa (PCR, por su sigla en inglés).

Se estudiaron 40 ratones B6C3-Tg de 20 a 30 g, asignados a dos grupos: el grupo control y el grupo tratado con AV, en dosis de 30 mg/kg por día por vía intraperitoneal, durante cuatro semanas. Se registró el peso corporal, el patrón de actividades y el consumo de agua y alimentos por los animales.

Dos días después del tratamiento se valoró el comportamiento de los animales en el laberinto acuático (prueba Morris Water Maze [MWM]), con algunas modificaciones, con la finalidad de conocer el aprendizaje espacial y la memoria.

Se realizaron cultivos primarios de células neuronales del hipocampo de los ratones B6C3-Tg. Las células del hipocampo, disociadas enzimáticamente, fueron cultivadas e incubadas con AV o solución salina; la expresión de beta-tubulina se valoró después de la administración de AV durante tres días; se determinó la longitud de los axones y el número de células con expresión de beta-tubulina, a los tres días de terapia.

Luego de la prueba de comportamiento, los animales fueron sacrificados. Cada cerebro se dividió en dos secciones; una de ellas se homogeneizó de inmediato para la extracción proteica, en tanto que la otra se utilizó para el estudio inmunohistoquímico y de inmunofluorescencia. Se analizó la expresión de beta-tubulina III, proteína tau fosforilada Ser262, BDNF y p-CREB-Ser133. Se calculó el porcentaje de células positivas en cortes de la corteza y en el hipocampo.

Las secciones tisulares de la región CA1 del hipocampo se analizaron con microscopia electrónica de transmisión. Las sinapsis se identificaron a partir de la existencia de al menos tres vesículas. La expresión de las proteínas correspondientes se valoró por medio de inmunoelectrotransferencia(Western blot). Las comparaciones estadísticas se realizaron con modelos de varianza (ANOVA) y pruebas de la t.

Resultados

En la prueba MWM, los animales del grupo activo y aquellos tratados con vehículo tuvieron un comportamiento similar, de modo que el AV no afectó la movilidad o la visión. Sin embargo, los animales tratados con AV tuvieron mejoras significativas en la latencia de escape y en la longitud de la trayectoria, respecto de los animales del grupo control. Se comprobaron disminuciones sustanciales en ambas pruebas (p < 0.05) en los animales tratados con AV, en los días 3, 4 y 5. Los animales atravesaron la plataforma en el cuadrante blanco significativamente más veces que los animales del grupo control, de modo que el tratamiento con AV mejoró considerablemente el aprendizaje espacial y la memoria en el modelo murino transgénico PPA/PS1 de EA.

El aprendizaje y la memoria se vinculan con cambios bioquímicos y morfológicos a nivel sináptico. El número de sinapsis en el hipocampo de los animales tratados con AV fue más alto, en comparación con el del grupo control, pero las diferencias no fueron significativas (t = 1.047; p = 0.322). Sin embargo, respecto de los ratones que recibieron solución salina, los animales del grupo activo presentaron un incremento importante en el número y la densidad de las vesículas sinápticas.

Se observaron cambios morfológicos en los cerebros de los dos grupos. En los animales del grupo control, la mayoría de las sinapsis fueron de tipo III; pocas fueron asimétricas, con membranas presinápticas y postsinápticas ligeramente curvadas. En los animales tratados con AV se observaron más sinapsis asimétricas, cóncavas o convexas. El tratamiento con AV durante cuatro semanas aumentó, de manera importante, la densidad postsináptica (t = 4.797; p = 0.020). En cambio, el ancho de la hendidura sináptica y la longitud de la zona sináptica activa no difirieron, de manera significativa, entre los animales tratados con AV y aquellos del grupo control. El tratamiento con AV se asoció con un aumento sustancial del número de vesículas presinápticas.

La función sináptica se asocia con la función cognitiva y depende de la integración normal de los receptores de glutamato. La expresión de la proteína PSD-95 en la corteza y en el hipocampo de los animales que recibieron AV fue significativamente más alta, respecto de la del grupo control (t = 6.570; p = 0.002). La expresión de GAP-43 también fue considerablemente mayor en los animales tratados con AV (t = 6.103; p = 0.0017).

En la EA, la pérdida importante de axones cerebrales es uno de los trastornos funcionalmente e histopatológicos más relevantes. En los animales del grupo control se comprobaron abundantes axones distróficos, mientras que los axones de los animales tratados con AV crecieron bien y estuvieron ordenados; el número de axones anormales fue muy inferior. Luego de cinco días de tratamiento con AV, las células primarias fueron más abundantes y largas respecto de las observadas en los animales del grupo control. Se constató un mayor número de axones por célula (t = 4.293; p = 0.002) y mayor longitud del axón más prolongado por célula (t = 4.031; p = 0.003).

En un paso posterior se evaluó si la reducción de los axones distróficos, en los animales tratados con AV, fue secundaria a la menor hiperfosforilación de la proteína tau. La inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia revelaron que las células p-tau-Ser262 positivas se distribuyeron en varias regiones cerebrales, como la corteza cerebral, el hipocampo, el cerebelo y el bulbo olfatorio. La densidad óptica de las células p-tau Ser262 positivas en la corteza y el hipocampo de los animales tratados fue sustancialmente inferior, respecto del grupo control (p < 0.05, en los dos casos). No se registraron diferencias significativas en los niveles de proteína tau total entre los grupos; sin embargo, los niveles de proteína tau fosforilada estuvieron considerablemente reducidos a 78.4% y 37.8% (Ser262 y Ser396, respectivamente) en los animales transgénicos tratados con AV. Por lo tanto, el tratamiento con AV atenuó considerablemente la hiperfosforilación de tau en los cerebros de los ratones PPA/PS1.

Los ratones que recibieron AV tuvieron un aumento significativo de los niveles de pSer9-GSK-3b, en comparación con los animales del grupo control (p < 0.05), aunque los niveles de GSK-3b total fueron semejantes en los dos grupos. Se confirmó, por lo tanto, que el tratamiento con AV inhibe significativamente la actividad de GSK-3b en los cerebros de los ratones PPA/PS1.

El CREB es uno de los factores de transcripción, regulados por GSK-3b. Mediante inmunohistoquímica se comprobó que las células p-Ser133-CREB positivas estuvieron distribuidas en todas las regiones del hipocampo y en los campos corticales. La densidad óptica de estas células en los animales que recibieron AV fue sustancialmente más alta, respecto del grupo control (p = 0.0021); también se comprobó un incremento significativo del número de células positivas en los ratones tratados con AV, respecto de los controles (p = 0.003). La inmunoelectrotransferencia confirmó que el nivel de proteína p-Ser133-CREB en los animales tratados aumenta considerablemente, respecto de los ratones del grupo control (p = 0.001); en cambio, el nivel de CREB total no difirió significativamente entre los dos grupos (p = 0.001).

El CREB se fija a las regiones promotoras de varios genes, incluso el gen del BDNF, asociado con la memoria y la plasticidad sináptica. El tratamiento con AV aumentó considerablemente la densidad óptica promedio de las células BDNF positivas, en los ratones PPA/PS1. La densidad óptica de las células BDGF positivas fue mucho mayor en la corteza y el hipocampo de los animales tratados (p = 0.000 y p = 0.004, respectivamente). Los niveles de BDNF también se incrementaron sustancialmente en los ratones que recibieron AV (p = 0.001). Por lo tanto, el AV atenúa la disfunción sináptica, al activar la vía de señalización GSK-3b-CREB-BDNF.

Discusión

La EA es uno de trastornos vinculados con la disfunción de la GSK-3b, cuya hiperactividad se vincula estrechamente con la formación de Ab, la hiperfosforilación de la proteína tau y la pérdida neuronal. Es por ello que en los últimos años se ha prestado mucha atención a los inhibidores de la GSK-3b, como posibles agentes para el tratamiento de la EA.

En el modelo murino de EA utilizado en esta ocasión, el AV mejoró el aprendizaje espacial y la memoria. Luego de cuatro semanas de terapia se comprobó un engrosamiento de la densidad postsináptica y un aumento importante del número y la densidad de las vesículas presinápticas; además, el AV indujo una mayor expresión de los marcadores proteicos sinápticos, GAP43 y PSD-95, los cuales se distribuyen en las membranas presinápticas y postsinápticas e intervienen en el remodelado y la regeneración de los axones y la función sináptica, respectivamente. En conjunto, los hallazgos indican que el tratamiento con AV reduce sustancialmente las deficiencias estructurales y funcionales de las sinapsis, en el modelo murino de EA.

En condiciones fisiológicas, el ensamblaje de los microtúbulos y el transporte axonal están regulados por la proteína tau asociada con los microtúbulos; la hiperfosforilación de la proteína compromete el funcionamiento normal de los microtúbulos y las sinapsis y el transporte axonal. El tratamiento con AV disminuyó considerablemente la expresión de p-tau-Ser262 y de p-tau-Ser396; en cambio, la terapia aumentó sustancialmente los niveles de p-Ser-GSK-3b.

Conclusión

Los resultados en conjunto del presente trabajo sugieren que el AV podría mejorar considerablemente la memoria, normalizar la estructura de las neuronas del hipocampo, estabilizar la integración estructural de las células y acelerar el crecimiento de los axones, al inhibir la GSK-3b, reducir la hiperfosforilación anormal de tau y aumentar la expresión de CREB y de BDNF.

 

Especialidad: Bibliografía - Neurología