Mecanismos Involucrados en los Efectos Apoptóticos de la Capsaicina en Células de Cáncer de Pulmón de Células Pequeñas

• TITULO : Mecanismos Involucrados en los Efectos Apoptóticos de la Capsaicina en Células de Cáncer de Pulmón de Células Pequeñas
• AUTOR : Lau J, Brown K, Dasgupta P y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Capsaicin Induces Apoptosis in Human Small Cell Lung Cancer Via the TRPV6 Receptor and the Calpain Pathway
• CITA : Apoptosis 19(8): 1190-1201, Ago 2014
• MICRO : La capsaicina induce apoptosis en células de cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) de los seres humanos mediante el receptor de potencial vaniloide (TRPV) 6 y la vía de las calpaínas. En este contexto, el TRPV6 podría ser un blanco molecular interesante para el tratamiento del CPCP humano.

Introducción

El cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) constituye el 13% de todos los cánceres de pulmón y es la forma más agresiva, con una supervivencia global a los cinco años de menos de 5%.

Diversos estudios sugirieron que ciertos productos de la dieta, aisladamente o en combinación con la quimioterapia, pueden suprimir el crecimiento de las células de algunos tumores. La capsaicina es el ingrediente picante de los chiles; en los trabajos experimentales con animales, la capsaicina suprimió la carcinogénesis en la piel, el colon, la lengua, los pulmones y la próstata. Se ha visto que la capsaicina motiva la interupción del ciclo celular en las células de carcinoma epidermoide, carcinoma de próstata, CPCP y cáncer de mama de los seres humanos, en modelos in vitro e in vivo. La capsaicina, en concentraciones elevadas, induce apoptosis de diversos tipos de células de tumores humanos, como cáncer de mama y cáncer gástrico. También se comprobó que la exposición prolongada a la capsaicina motiva fuertemente la apoptosis en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, en la leucemia de células T, en el carcinoma de esófago, en el astroglioma y en células de cáncer de próstata y de colon. Las células normales, en cambio, no son afectadas por la capsaicina.

La sensación de calor asociada con la capsaicina está mediada por el receptor de potencial vaniloide (transient receptor potential vanilloid 1[TRPV1]), el cual pertenece a la superfamilia de los receptores de potencial transitorio (transient receptor potential [TRP]). La familia de receptores TRPV está integrada por seis miembros (TRPV1 a TRPV6); la capsaicina se une con elevada afinidad al receptor TRPV1.

La inhibición del crecimiento de células tumorales, asociada con la capsaicina, obedece a la formación de especies reactivas de oxígeno y peroxinitrito, la estabilización de p53 y la inhibición de la actividad de la NADH oxidasa, entre otros mecanismos.

El efecto apoptótico de la capsaicina en células de cáncer de próstata no dependiente de andrógenos, gliomas y cáncer urotelial está mediado por el receptor TRPV1; la unión de la capsaicina al TRPV1 motiva la estimulación de la p38 MAP quinasa, mayor permeabilidad mitocondrial y activación de la caspasa 3; el resultado final es la apoptosis. En los cánceres uroteliales, la capsaicina causa el agrupamiento de los receptores TRPV1, con lo cual se estimula la vía del Fas, por medio de la ATM quinasa. La capsaicina también regula la función del receptor TRPV6; en cambio, los restantes receptores de la familia no responden a la capsaicina.

Hasta ahora, los mecanismos responsables de los efectos apoptóticos de la capsaicina en células de CPCP no se conocen; en estudios experimentales, la apoptosis dependió de la familia de los receptores TRPV, pero no del TRPV1. Se han encontrado niveles altos de TRPV6 en las células del CPCP de los seres humanos, pero no en el epitelio pulmonar normal. En opinión de los autores, la diferente expresión del TRPV6 explicaría, al menos en parte, la especificidad de la capsaicina por las células de cáncer de pulmón, respecto de las células pulmonares normales.

El objetivo del presente estudio fue conocer las vías involucradas en la actividad apoptótica de la capsaicina en células de CPCP in vitro e in vivo.

Materiales y métodos

Se utilizaron las líneas celulares de CPCP de seres humanos NCI-H82, NCI-H69 (H82 y H69, respectivamente), DMS 53 y DMS 114, y células epiteliales bronquiales y de la pequeña vía aérea. En el lisado de las células, expuestas a diferentes concentraciones de capsaicina, se determinó la apoptosis, por medio de la valoración de la actividad de la caspasa 3 y del patrón de fragmentación del ADN (contenido de PARP [poli-ADP-ribosa polimerasa] fragmentado, mediante enzimoinmunoensayo [ELISA]). Las células tratadas con cisplatino 10 uM se utilizaron como control positivo.

Los estudios in vivo se realizaron con ratones atímicos de cuatro semanas, en los cuales se inyectaron células DMS 53 por vía subcutánea. Cuando los tumores tuvieron un volumen de 100 mm3, los animales fueron asignados a dieta normal o a la dieta con capsaicina (50 mg de capsaicina por kg de alimento). Los animales fueron pesados una vez por semana. El tratamiento con capsaicina se mantuvo hasta que los tumores de los animales del grupo control alcanzaron un volumen de 1000 mm3. Luego, los animales fueron sacrificados y se extirparon los tumores para estudio inmunohistoquímico y para valorar la actividad de la caspasa 3 con equipos comerciales. Los resultados se confirmaron con ELISA (ensayo Cleaved PARP ELISA®)

Mediante inmunohistoquímica se determinó la expresión del TRPV6 en células de CPCP y en células pulmonares normales.

Los experimentos de transfección con pequeños ARN de interferencia (siRNA, por su sigla en inglés) se realizaron en las líneas celulares DMS 53 y DMS 114. Las células fueron transfectadas con siRNA de TRPV6 y siRNA control; 18 horas después de la transfección, las células fueron tratadas con 50 μM de capsaicina durante 36 horas. El efecto de la transfección de siRNA de TRPV6 sobre la actividad apoptótica de la capsaicina se analizó mediante la valoración de la actividad de la caspasa 3 con equipos comerciales; los resultados se confirmaron con ELISA. La expresión de TRPV6 luego de la transfección de siRNA en todas las líneas celulares de CPCP se determinó con inmunoelectrotransferencia (Western blot).

En las líneas celulares se determinó la actividad de las calpaínas, con equipos comerciales de fluorescencia. Las comparaciones estadísticas se realizaron con modelos de varianza ANOVA y pruebas de Neumann-Keuls para comparaciones múltiples.

Resultados

La capsaicina indujo la muerte celular programada, valorada con la actividad de la caspasa 3, a las 36 horas. La mayor apoptosis se observó con la exposición a capsaicina, en concentración de 50 µM, pero se mantuvo estable con concentraciones más altas. El incremento de la muerte celular tuvo lugar a las 24 horas, pero fue máximo a las 36 horas. Por lo tanto, en los experimentos posteriores se utilizó capsaicina 50 µM, durante 36 horas. Se comprobó la misma actividad apoptótica en las líneas H69, DMS 114, DMS 53 y H82 tratadas con capsaicina. Los resultados se confirmaron con el ensayo comercial PARP Cleavage ELISA y con el ensayo TUNEL. Los hallazgos en todos los ensayos de apoptosis fueron similares.

En las células pulmonares normales (células epiteliales bronquiales y de las vías aéreas pequeñas), el tratamiento con capsaicina no indujo apoptosis, de modo que se confirmó que el efecto proapoptótico de la capsaicina ocurre en células de CPCP, pero no en células normales.

En los modelos experimentales in vivo, el tratamiento con capsaicina disminuyó el índice de crecimiento tumoral, en los ratones atímicos con xenoinjertos del CPCP DMS 53. El tratamiento con capsaicina se toleró bien; no se observó disminución del peso corporal. Los lisados de los tumores de los animales tratados con capsaicina presentaron dos a tres veces más apoptosis (actividad de la caspasa 3), en comparación con los ratones del grupo control. La apoptosis en los tumores de los animales tratados con capsaicina se confirmó en todos los ensayos y en los estudios histológicos con tinción con hematoxilina y eosina.

En un paso posterior se investigaron los mecanismos moleculares involucrados en la actividad apoptótica de la capsaicina; en un estudio previo se comprobó que la actividad biológica de la capsaicina está mediada por los receptores TRPV. El tratamiento de las líneas celulares DMS 53 y DMS 114 con rojo de rutenio, un antagonista de todos los TRPV, anuló por completo el efecto apoptótico de la capsaicina.

La capsaicina es un ligando del TRPV1. Sin embargo, el tratamiento con los inhibidores de TRPV1, capsazepina y SB366791, no afectó la acción apoptótica de la capsaicina en las células DMS 53 y DMS 114, de modo que en la apoptosis de células de CPCP no parece intervenir el TRPV1.

Debido a que la capsaicina sólo regula la acción del TRPV1 y del TRPV6, en el paso siguiente se evaluó la posible participación de este último en el efecto proapoptótico. En primer lugar, mediante inmunoelectrotransferencia (Western blot) y ELISA, se confirmó la expresión de TRPV6 en las 4 líneas de CPCP humano. En cambio, las células epiteliales del tejido pulmonar normal expresaron levemente el TRPV6, en comparación con las líneas de tumores, un fenómeno que explica, en parte, la selectividad de la capsaicina por las células tumorales. Los hallazgos se confirmaron en el estudio inmunohistoquímico en 70 muestras de CPCP, en las cuales se observó una fuerte expresión citoplasmática de TRPV6. El nivel de expresión de TRPV6 fue cuatro a cinco veces más alto, en comparación con la expresión observada en el epitelio pulmonar normal.

El papel del TRPV6 en la apoptosis inducida por capsaicina se evaluó con técnicas de transfección con siRNA. La depleción de TRPV6 revirtió la actividad apoptótica de la capsaicina en células DMS 53 y DMS 114.

El papel del calcio en la apoptosis inducida por capsaicina se evaluó en modelos experimentales con BAPTA-AM, un quelante del calcio. La incubación con BAPTA-AM 10 µM se asoció con una reducción significativa de la apoptosis inducida por capsaicina, en las células DMS 53 y DMS 114. Los resultados indicaron, entonces, que la capsaicina induce apoptosis por medio del aumento de los niveles intracelulares de calcio. Más aun, la actividad apoptótica estuvo fuertemente inhibida por el inhibidor de calpaínas, calpeptina; por lo tanto, la activación de la calpaína 1 y de la calpaína 2 participaría en los efectos apoptóticos de la capsaicina.

La capsaicina aumentó la actividad de las calpaínas en alrededor de tres veces, en las células DMS 53 y DMS 114; la actividad de las calpaínas, inducida por la capsaicina, se revirtió en presencia del quelante de calcio, BAPTA-AM; sin embargo, la capsaicina no modificó los niveles de calpaína 1 ni de calpaína 2. Los experimentos de transfección con siRNA de TRPV6 confirmaron que la capsaicina induce apoptosis de las células de CPCP por medio de los receptores de TRPV6 y la activación de la familia de las calpaínas.

Discusión

La familia de los receptores TRPV está compuesta por seis miembros (TRPV1-6). Los hallazgos del presente estudio indican que los efectos apoptóticos de la calpaína son independientes del TRPV1; en cambio están mediados por los receptores TRPV6. En un estudio previo, el TRPV6 estuvo directamente involucrado en la supervivencia de células de cáncer de próstata; los trabajos en otros tumores confirmaron este mecanismo de acción.

En la familia de los TRPV, el TRPV6 es uno de los canales iónicos con mayor selectividad por el calcio; su principal función es regular el transporte de calcio, su reabsorción y homeostasis en los tejidos epiteliales. Recientemente se demostró que el TRPV6 se expresa de manera exagerada en los carcinomas de ovario, mama, colon, próstata y tiroides. La expresión diferencial del TRPV6 en el CPCP, respecto del tejido pulmonar normal, sugiere que esta molécula podría ser un nuevo blanco terapéutico.

La capsaicina es uno de los elementos asociados con aumento de la expresión de TRPV6; el mayor contenido intracelular de calcio participaría en la apoptosis inducida por capsaicina. En el presente estudio, la actividad apoptótica de la capsaicina fue dependiente del calcio intracelular y de la vía de las calpaínas. Las calpaínas son una familia de cisteín proteasas dependientes del calcio que regulan diversos procesos, como la división celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis. Los flavonoides y los polifenoles del té inducen activación de la vía de las calpaínas y, por lo tanto, apoptosis de diversas células de cánceres humanos. Por primera vez, los hallazgos del presente estudio indican que la activación de las calpaínas, asociada con la capsaicina, tiene lugar corriente abajo del receptor TRPV6 en las células de CPCP. Los resultados en conjunto sugieren que ciertos compuestos alimentarios (o moléculas pequeñas) que tienen como blanco el receptor TRPV6 podrían ser útiles para el tratamiento del CPCP.

Especialidad: Bibliografía - Oncología