Angiogénesis en el Carcinoma Pulmonar no Microcítico: Efecto Inhibitorio de la Capsaicina

• TITULO : Angiogénesis en el Carcinoma Pulmonar no Microcítico: Efecto Inhibitorio de la Capsaicina
• AUTOR : Chakraborty S, Adhikary A, Das T y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Capsaicin-Induced Activation of p53-SMAR1 Auto-Regulatory Loop Down-Regulates VEGF in Non-Small Cell Lung Cancer to Restrain Angiogenesis
• CITA : PLos One 9(6), Jun 2014
• MICRO : La capsaicina inhibe la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular secretado por las células del carcinoma pulmonar no microcítico, mediante la activación del circuito autorregulador p53-SMAR1, el que determina la inhibición de la expresión de dicho factor de crecimiento, de Cox-2 y de la traslocación nuclear de HIF-1alfa.

Introducción

El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, por su sigla en inglés) está implicado en la inducción de la pronunciada angiogénesis característica en el tejido tumoralobservada en el carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM). En condiciones de hipoxia tisular, su expresión se ve incrementada, y el factor inducible por la hipoxia 1 alfa (HIF-1alfa [hipoxia-inducible factor-1]) es el responsable de regular dicha respuesta. Por otra parte, en determinadas condiciones de estrés celular, la expresión de HIF-1 es inhibida por p53, la cual participa de los procesos moleculares activados por las señales de alteración o daño en el ADN. En ese contexto, es la SMAR1 (scaffold matrix-associated region-binding protein) la que inhibe la degradación de p53 por el proteosoma mediada por Mdm2 y la acetilación de dicha proteína. Asimismo, la ciclooxigenasa 2 (Cox-2), en células cancerosas, antagoniza la cascada inhibitoria activada por p53.

El conocimiento de estas vías moleculares resulta fundamental si se considera que se encuentran implicadas en el crecimiento de los vasos sanguíneos en el tumor y, por ende, en el mantenimiento de éste y su propagación a otros tejidos del cuerpo (metástasis). En particular, el carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM), caracterizado por células no pequeñas, constituye el 80% de los casos de cáncer de pulmón y se encuentra dentro del grupo de cánceres resistentes al tratamiento (quimioterapia y radioterapia). En la búsqueda de una terapia que detenga el crecimiento tumoral se ha utilizado un alcaloide extraído del pimiento picante, la capsaicina (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida), la cual, en modelos murinos de cáncer pulmonar inducido, actúa como factor apoptótico y regulador de la actividad de las proteínas tumorales y enzimas que metabolizan los xenobióticos. La inducción de la muerte celular por la capsaicina se ha observado en células de carcinoma pulmonar microcítico y no microcítico.

En este contexto, el objetivo del presente estudio fue determinar si la capsaicina ejercería funciones inhibitorias de la angiogénesis en el CPNM, de manera de impedir la progresión de la enfermedad.

Métodos

Se procedió a realizar cultivos de células A549 (línea celular de CPNM), células WI-38 (fibroblastos normales de pulmón) y de células endoteliales HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), las cuales fueron utilizadas en los experimentos en sus fases número 2 a 5.

En los experimentos específicos se aplicó 100 µl/mol de CoCl2 para producir hipoxia y se realizaron tratamientos con VEGF (0.8 ng/ml) 6 horas antes de recoger las células para evaluar los resultados correspondientes.

El ensayo de wound healing consistió en realizar raspados con un tip de micropipeta de 100 µl en un cultivo de células HUVEC que formaban una monocapa confluente en una placa, dejarlas crecer en presencia o en ausencia de capsaicina y proceder a evaluar la migración celular en el sitio del raspado en las diferentes placas. Asimismo, se evaluó el crecimiento de brotes vasculares mediante el ensayo de sprout formation, el cual refleja la capacidad de las células HUVEC para formar estructuras tubulares (cordón endotelial) luego de haber sido cultivadas en matrigel en presencia o ausencia de capsaicina.

La evaluación bioquímica de los cambios en las proteínas celulares se realizó mediante su detección en lisados de proteínas totales con anticuerpos específicos que se unieran a VEGF, HIF-1alfa, p53, Cox2 y SMAR1 por Western blot.

La muerte celular se determinó mediante el marcaje con ioduro de propidio y anexina-V-FITC y la subsiguiente detección por citometría de flujo.

En la cuantificación de los niveles de proteína se utilizó citometría de flujo y ELISA y la apreciación en sus cambios cualitativos se realizó mediante la visualización del cultivo por microscopia confocal.

En la evaluación molecular se aplicó la técnica de la transcripción inversa (RT, por su sigla en inglés) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) para detectar mediante primers específicos la expresión de VEGF, HIF-1alfa, SMAR1 y Cox-2. Se utilizó GAPDH como control interno. Por otra parte, los plásmidos transfectados en el cultivo celular mediante lipofectamina-2000, fueron: pcDNA3.1 p53, pcDNA3.1 SMAR1 y pcDNA3.0 Cox-2 o SMAR1-shARN (300 pmol/106 células) y pcDNA3.0 (vector control, 2 mg/106 células). Para los ensayos de silenciamiento se transfectaron los siARN específicos para HIF-1alfa y Cox-2 (300 pmol) y el shARN específico para p53.

Para el estudio de los sitios de unión de SMAR1 en el promotor de Cox-2 se aisló el ADN mediante inmunoprecipitación de cromatina con el anticuerpo anti-SMAR1/BANP (BTG-3 associated nuclearprotein), se amplificó por PCR y se secuenció mediante primers específicos para el promotor de Cox-2. Asimismo, la cuantificación de la expresión de VEGF y HIF-alfa en células Hy-A549 tratadas con capsaicina se realizó mediante PCR en tiempo real.

Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Resultados

Se procedió a establecer las células y las condiciones que determinarían una mayor estimulación de la angiogénesis. En este sentido, se cultivó a las células HUVEC con su medio de crecimiento (control) o con un medio condicionado proveniente de cultivos de WI-38, de células A549 o de éstas en condiciones de hipoxia (Hy-A549). De esta forma, se observó que el mayor porcentaje de migración de las células HUVEC fue en presencia del medio condicionado proveniente de los cultivos de Hy-A549, su diferencia fue significativa respecto del control y superior al de las células que crecieron en medio condicionado proveniente de los cultivos de A549. Al evaluarse el efecto de la capsaicina en el potencial angiogénico del medio condicionado de células Hy-A549, se verificó que el medio proveniente de estas células tratadas con capsaicina (35 uM) por 24 horas inhibía la migración de las células HUVEC. Dicha disminución en la migración no se debía a la reducción en el número de células provocada por el aumento en la muerte celular por toxicidad de la capsaicina a la concentración utilizada o a la activación temprana de programa apoptótico. Asimismo, en concordancia con estos resultados, la utilización de medio condicionado de células Hy-A549 tratadas con capsaicina, en las células HUVEC, produjo alteraciones en el desarrollo de la red tubular, con lo que se encontraron en el ensayo de matrigel estructuras de menor diámetro y longitud respecto de las HUVEC cultivadas con medio condicionado de las células Hy-A549. El VEGF derivado de las células Hy-A549 modulaba la migración de células HUVEC y la formación del brote vascular, ya que al agregarse su proteína recombinante al medio de células Hy-A549 pretratadas con capsaicina, dicho factor de crecimiento lograba contrarrestar el efecto inhibitorio de este medio condicionado en los procesos antes mencionados. Asimismo, la capsaicina produjo una disminución significativa en la expresión y en los niveles intracelulares de la proteína VEFG. De acuerdo con lo observado en células Hy-A549, una posible explicación de los niveles reducidos de dicha proteína podría ser el efecto de la capsaicina sobre HIF-1alfa, ya que como consecuencia de este tratamiento la expresión de la proteína HIF-1alfa disminuyó, lo cual afectaría de manera específica a el VEGF, cuya expresión es modulada por HIF-1alfa (las células Hy-A549 transfectadas con siARN específicos para HIF-1alfa presentaron una reducción en la expresión de VEGF respecto del control y su medio condicionado redujo la migración de las células epiteliales). No obstante, existirían vías adicionales implicadas en la disminución de los niveles de VEGF, ya que en el presente estudio la capsaicina produjo una mayor reducción en la expresión de este factor de crecimiento en las células en las que se encontraba silenciada HIF-1alfa.

Es importante destacar que p53 media la degradación por proteosoma de HIF-1alfa, observándose en células Hy-A549, en las que p53 fue silenciado, una disminución en las especies ubiquitinadas de HIF-1alfa, comparable al incremento inducido por la capsaicina en células Hy-A549.En este sentido, la capsaicina provocó un aumento en la transcripción y en la traducción de p53 y en su activación mediante un incremento de las especies fosforiladas (p-Ser15-p53). Asimismo, en células Hy-A549 en las que se realizó el silenciamiento de p53, la expresión de VEGF aumentó significativamente.

La traslocación nuclear de HIF-1alfa en células Hy-A549 fue inhibida por capsaicina vía p53, ya que el silenciamiento de esta proteína contrarrestó dicha inhibición, restaurando los niveles nucleares de HIF-1alfa, los cuales disminuyeron significativamente luego del tratamiento con capsaicina. Asimismo, la capsaicina afectó el transporte nuclear de HIF-1alfa, disminuyendo significativamente la expresión del mensajero y la proteína Cox-2, enzima implicada en la síntesis de PGE2, proteína necesaria para la localización nuclear de HIF-1alfa. Por otra parte, el silenciamiento de p53 determinó un aumento en la expresión génica y en la proteína de Cox-2.

La acción de la capsaicina sobre SMAR1, represor transcripcional que interacciona con p53, parece estar mediada por esta última, ya que en las células Hy-A549 que expresaban p53-shARN el aumento en el transcripto y en la proteína SMAR1, inducido por la capsaicina, fue inhibido. No obstante, la relación SMAR1-p53 es bidireccional, ya que el silenciamiento de SMAR1 provocó la disminución de los niveles de la proteína p53 fosforilada. En este sentido, se postula que p53 regula positivamente la expresión de SMAR1, y esta proteína promueve la estabilización de p53 y, por ende, su función. Por otra parte, SMAR1, mediante su interacción con los sitios de unión en el promotor de Cox-2, aislados y secuenciados en el presente estudio, actuaría inhibiendo la expresión de Cox-2 en células Hy-549 tratadas con capsaicina. Dicho efecto pudo ser comprobado en células que expresaban el SMAR1-shARN, en las cuales, al ser tratadas con capsaicina, no se observó el efecto inhibitorio característico sobre Cox-2. Asimismo, en condiciones de silenciamiento de SMAR1, se produjo el incremento transcripcional de HIF-1alfa y VEGF.

Discusión

El VEGF es una proteína clave en la angiogénesis y, por lo tanto, su modulación en las terapias de tratamiento del CPNM es esencial.

La condición de hipoxia de las células de CPNM generada por su localización distante respecto de los capilares, determina un incremento en la expresión de VEGF y su receptor, mediada por HIF-1alfa. En este contexto, el efecto de la capsaicina consiste en reactivar el circuito autorregulador p53-SMAR1, en donde p53 induce una mayor expresión de SMAR-1, y esta proteína estabiliza a p53. De esta forma, p53 promueve la ubiquitinación de HIF-1alfa y la disminución de su transcripción. Por otra parte, la traslocación nuclear de HIF-1alfa se ve comprometida, ya que SMAR1 inhibe la expresión de Cox-2, implicada en la síntesis de PGE-2, necesario para la localización nuclear de HIF-1alfa. Como consecuencia, disminuye significativamente la expresión de VEGF, con lo cual se ve alterada la formación de la red de células endoteliales, evento previo a la angiogénesis.

Conclusión

La eficacia demostrada de la capsaicina en inhibir (en dosis que no generen toxicidad) la angiogénesis inducida por el VEGF secretado por las células de CPNM, mediante la activación del circuito autorregulador p53-SMAR1, determina una nueva opción terapéutica en reemplazo de otros fármacos que presentan efectos citotóxicos.

Especialidad: Bibliografía - Oncología