Potencial del Agente Nutricional Capsaicina Contra el Cáncer Pulmonar de Células Pequeñas

• TITULO : Potencial del Agente Nutricional Capsaicina Contra el Cáncer Pulmonar de Células Pequeñas
• AUTOR : Brown K, Witte T, Dasgupta P y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Capsaicin Displays Anti-Proliferative Activity Against Human Small Cell Lung Cancer in Cell Culture and Nude Mice Models Via the E2F Pathway
• CITA : PLos One 5(4), Abr 2010
• MICRO : El cáncer de pulmón de células pequeñas es sumamente agresivo, con una supervivencia a 5 años menor del 5%. Por ello, son necesarias nuevas estrategias de tratamiento. Dentro de ellas, se ha estudiado la efectividad del agente nutricional capsaicina, que ha demostrado actividad antiproliferativa in vitro e in vivo.

Introducción y objetivos

El cáncer de pulmón de células pequeñas humano (CPCPH) representa el 13% de los cánceres de pulmón y es sumamente agresivo, con una supervivencia global a 5 años menor del 5%. Recientemente se ha avanzado en el conocimiento de los eventos involucrados en el desarrollo del CPCPH, lo que ha permitido identificar posibles agentes para intervenciones terapéuticas. Dentro de ellos se encuentran los agentes nutricionales que manifiestan actividad antiproliferativa, como la capsaicina (Cps), el principal componente de los pimientos o chiles.

Este componente es utilizado de manera tópica para el tratamiento del dolor y la inflamación en diversas enfermedades. Estudios de quimioprevención han demostrado que también puede suprimir la carcinogénesis de la piel, el colon, el pulmón, la lengua y la próstata; sin embargo, sólo unos pocos estudios han direccionado su potencial como un agente anticanceroso.

La Cps ha demostrado inducir la apoptosis de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, de leucemia de células T, de cáncer de esófago, de astroglioma, de próstata, de colon y de estómago en modelos de cultivos celulares, y suprime el crecimiento del cáncer de próstata en modelos de ratones atímicos.

También se ha descubierto que la Cps induce la detención del ciclo celular en la fase G1 en células de cáncer humano, como el cáncer epidermoide y el de próstata, a través de la inducción de p53 y de la inhibición de la ciclina dependiente de kinasa (cdk) p21, y en la leucemia HL-60, a través de la inhibición de la actividad de cdk2. En las células endoteliales genera una actividad antiangiogénica. Esta detención en la fase G1 se relaciona con la supresión de los niveles de ciclina D1, la inhibición de la actividad de la cdk4 y la fosforilación de Rb en las células de cáncer endotelial y de mama. Todos estos conocimientos sugieren que la actividad antiproliferativa de la Cps está mediada por sus efectos en la vía E2F-Rb.

La familia de factores de transcripción E2F consta de 8 genes miembros, que, aunque se enlazan con el mismo sitio de reconocimiento del ADN, cumplen distintos roles en la regulación del ciclo celular y en la proliferación celular. E2F1, E2F2 y E2F3 se consideran activadores, ya que su transcripción activa genes proliferativos como la ciclina E, el cdc 25A y el cdc 6; estos inducen la entrada de las células en fase S y, por consiguiente, la progresión del ciclo celular. En contraste, E2F4 y E2F5 son represores porque reprimen la transcripción de los genes proliferativos. E2F6, E2F7 y E2F8 también son represores, pero su función es poco conocida aún por ser los últimos descubiertos.

La actividad E2F es regulada rigurosamente por la familia de proteínas Rb, p130 y p107. Las células quiescentes contienen altos niveles de proteínas E2F ligadas a ellas; el inicio de estímulos mitógenos causa, a través de la ciclina D, E y sus kinasas asociadas, la fosforilación de estas proteínas, su inactivación y su disociación de E2F. Las E2F libres se unen a promotores proliferativos como la ciclina E, la timidilato sintasa (TS), la cdc 25A y la cdc6, que regulan el ciclo celular.

Estudios previos han demostrado que la mayoría de los CPCPH tienen mutaciones en Rb y p53 y desregulación de la vía E2F-Rb. La actividad antiproliferativa de la Cps no ha sido estudiada en CPCPH.

Los autores del presente estudio han sugerido la hipótesis de que la Cps posee actividad antiproliferativa en el CPCPH mediante la regulación de la actividad de la familia de factores de transcripción E2F. El objetivo del estudio fue explorar la actividad antiproliferativa de la Cps en el CPCPH in vitro e in vivo.

Pacientes y métodos

Cultivo celular y transfección

Se eligieron cuatro líneas celulares: NCI-H69 (H69), NCI-H82 (H82), DMS53 y DMS114; ellas fueron seleccionadas debido a que están ampliamente estudiadas y poseen características físicas, morfológicas, bioquímicas, moleculares y de crecimiento que se asemejan al CPCPH en los pacientes. También se obtuvieron células normales del epitelio bronquial (NHBE) y de la pequeña vía aérea (SAEC). Todas ellas se cultivaron en distintos medios de cultivo específicamente preparados.

Ensayo de MTT

Se incubaron placas con las líneas celulares antes mencionadas con un agregado de solución de MTT, según el protocolo establecido. Se midió la absorbancia de las placas con un lector de ELISA con una longitud de onda de 540 nm.

Ensayos de proliferación BrdU y PCNA

Estos ensayos fueron utilizados para examinar los efectos de la Cps en la proliferación de las cuatro líneas celulares del CPCPH. La BrdU (bromodeoxiuridina) es un análogo nucleótido de timidina que se incorpora durante la fase S, en lugar de timidina, únicamente en el ADN de células en proliferación. Se colocaron en placas e incubaron todas las líneas celulares antes mencionadas; luego se reestimularon durante 18 horas (tiempo que se requiere para el ingreso a la fase S) con 10% de suero fetal bovino (FBS), en presencia o en ausencia de Cps, y luego se colocaron en un medio con factores de crecimiento. La tasa de incorporación de BrdU se midió por ELISA y el porcentaje de células en fase S se cuantificó por evaluación colorimétrica.

La proliferación celular se evaluó a través de la medición de los niveles de PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) por ELISA, luego de una preparación celular especial, midiendo la absorbancia a 405 nm.

Análisis del ciclo celular

Se utilizaron las células de la línea H69 para realizar el análisis del ciclo celular, para lo cual se aplicó la técnica de yoduro de propidio. Las muestras se analizaron por citometría de flujo.

Lisado y Western blot

El lisado se realizó según el protocolo de lisis NP-40. Se obtuvo un sobrenadante para su posterior análisis y un concentrado de proteínas. Aquellas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La expresión relativa de dichas proteínas fue analizada por Western blot. Se utilizaron anticuerpos monoclonales E2F1, TS, cdc25A, cdc6, ciclina E y ß-actina, y anticuerpos policlonales E2F2 a E2F6 y GAPDH. Los resultados fueron cuantificados por análisis densitométrico.

Experimento en membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM)

Se incubaron huevos de pollo fértiles libres de enfermedad. El día 9, los huevos fueron iluminados y las ventanas abiertas para exponer la CAM. A la CAM de cada embrión de pollo se le aplicaron células H69 con Cps y se incubaron 4 días más. Luego se removieron los tumores implantados, se fotografiaron y se pesaron. Se analizaron 12 huevos para cada grupo.

Estudios antitumorales en ratones atímicos

Se utilizaron 8 ratones desnudos atímicos de 4 semanas. Se inyectaron células H69 entre las escápulas de cada ratón. Cuando el tumor alcanzó los 100 mm3, los ratones comenzaron a recibir una dieta que contenía un 10% de aceite de maíz, hasta que los tumores alcanzaron los 800 mm3. Luego, los animales se dividieron en dos grupos: el grupo tratamiento (n = 4), que recibió una dieta con 50 mg de Cps/kg de comida, y el grupo control (n = 4), que continuó con la dieta anterior. Los ratones se pesaron una vez por semana, se controló el consumo de alimento y se midió el tamaño del tumor diariamente. El tratamiento se continuó hasta que el tumor alcanzó los 2000 mm3; luego se extirpó, la mitad se preparó para lisado y la mitad para histoquímica.

Ensayos de escisión de caspasa

Se realizó con lisado de tumor preparado de los ratones control y de los tratados con Cps. Se utilizó el kit de escisión caspasa-3.

Inmunohistoquímica

Se utilizaron secciones de tejido de ratón de 4 μm. Las secciones fueron incubadas con anticuerpos monoclonales anti PCNA y luego de una preparación específica, fueron fotografiadas con microscopio BX41 de campo claro. Los datos se presentaron como porcentaje de células positivas PCNA.

Transfección siRNA

Los experimentos de transfección se ejecutaron en células H69 y DMS114. Luego de una técnica específica, las células fueron tratadas con 10% de FBS en presencia de 50 μM de Cps por 18 horas. Posteriormente se midió el porcentaje de células en fase S con el kit ELISA BdrU. Una secuencia siRNA no objetivo fue utilizada como control negativo para los experimentos de transfección. Los resultados de la transfección de E2F4 se verificaron mediante la utilización de un segundo set de siRNA independiente.

Se utilizó el análisis de Western blot para valorar la expresión de proteínas de la familia E2F luego de la transfección de siRNA, tanto en células H69 como DMS114.

PCR en tiempo real

Se utilizaron células H69 y se aisló el RNA total. Un μg de RNA fue tratado con DNasa, seguido de la sνntesis de una hebra de ADNc. Una fracción (1/20) del ADNc fue utilizada en cada PCR.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Se utilizaron células H69, que recibieron tratamiento específico, en ausencia o en presencia de Cps. Se emplearon 25 millones de células en cada reacción IP. Las células fueron tratadas con 1% de formaldehido para cruzar las proteínas y el ADN. En todas las reacciones se utilizaron como control anticuerpos secundarios de conejo antirratón. Se realizó PCR utilizando ADN de la inmunoprecipitación. Como control negativo de todos los experimentos se realizó la PCR del promotor c-Fos, que no es regulado por E2F.

Análisis estadístico

Todos los datos fueron expresados como media ± SEM y representados gráficamente a través de Graph Pad Prism 5. Las diferencias entre tratamientos y controles fueron evaluadas por análisis de varianza (ANOVA) seguido del test de comparación múltiple de Dunnet. Las tasas de crecimiento tumoral en ratones se analizaron por test de varianza ANOVA seguido del test de Neuman – Keuls. Se realizó el análisis de Chi cuadrado para determinar las diferencias en porcentaje de núcleo PCNA positivo. Los datos se expresaron con su intervalo de confianza del 95% y se consideró como significativo un valor de p < 0.05.

Declaración de ética

Todos los procedimientos que involucraron ratones se condujeron de acuerdo a las Guías de Cuidado y Uso Animal y los protocolos fueron aprobados por distintas instituciones.

Resultados

La capsaicina muestra actividad antiproliferativa en CPCPH in vitro

El ensayo MTT tuvo por finalidad determinar si la Cps puede suprimir el crecimiento de las células de CPCPH in vitro. Se observó que el tratamiento de las células de CPCPH H69, H82, DMS53 y DMS114 con 50 μM de Cps causa una disminuciσn en la viabilidad de estas cιlulas de una manera dependiente del tiempo, con el máximo efecto inhibitorio a las 72 h de tratamiento.

El ensayo BrdU se utilizó para examinar los efectos antiproliferativos de la Cps en cuatro líneas celulares de CPCPH (H69, H82, DMS53 y DMS114) y en dos líneas celulares epiteliales pulmonares normales (NHBE y SAEC). La Cps inhibió la proliferación de las células H69 de una manera dependiente de la concentración. La actividad máxima antiproliferativa se obtuvo con 50 μM de Cps y se mantuvo constante con dosis de 100 μM, por lo que en los siguientes experimentos se utilizσ una dosis de 50 μM. Se analizaron las otras lνneas celulares de CPCPH y se obtuvieron similares resultados, pero en las líneas celulares pulmonares normales, la actividad inhibitoria fue menor. Estos hallazgos constituyen un descubrimiento importante porque la Cps suprimiría el crecimiento de las células pulmonares cancerosas, con mínimo efecto sobre las células pulmonares normales.

Los resultados de los ensayos BrdU se verificaron posteriormente con la medición de los niveles de PCNA por ELISA en las células de CPCPH tratadas con Cps. Se observó que el tratamiento con Cps de las cuatro líneas celulares de CPCPH llevó a un 50% de inhibición en la entrada celular a fase S.

Finalmente, se realizó un análisis del ciclo celular por citometría de flujo para confirmar los resultados anteriores en las células H69. La Cps causó un incremento en la fracción de células en fase G1 y una disminución concomitante en el porcentaje de células en fase S.

En conjunto, los resultados demostraron por primera vez que la Cps posee actividad antiproliferativa en las células del CPCPH in vitro.

El efecto antiproliferativo de la capsaicina se correlaciona con la disminución de los genes E2F en fase S

Se buscó establecer si la detención del crecimiento inducido por la Cps se correlacionó con cambios en la expresión de los genes proliferativos E2F. Entre estos se seleccionaron los de la ciclina E, la TS, el cdc25A y el cdc 6. Como estos son genes objetivos E2F, se examinó si la Cps podía disminuir los niveles de ARNm por medio de PCR de tiempo real cuantitativa. Se observó que la expresión de esos genes estuvo significativamente regulada en descenso con 50 μM de Cps (p < 0.01). Los resultados se confirmaron con Western blot, este demostrσ en las cuatro lνneas celulares de CPCPH una supresión de los niveles de proteínas codificadas por dichos genes, que fue dependiente de la concentración.

En síntesis, la Cps suprimió la expresión de ciclina E, TS, cdc25A y cdc6, tanto en términos de ARNm como de niveles de proteínas, en el CPCPH.

La capsaicina inhibe el crecimiento de las células humanas H69 in vivo

La administración de 50 μM de Cps atenϊa significativamente el crecimiento de tumores de CPCPH H69 implantados en membrana CAM (p = 0.02). Estos resultados se confirmaron con la utilización de modelos de ratones atímicos, en los que la administración de Cps (10 mg/kg de peso corporal) redujo significativamente la tasa de crecimiento de tumores H69 xenotrasplantados.

Se obtuvieron secciones de tejido tumoral, que fueron analizadas por inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales para PCNA. Se encontró una reducción significativa de células positivas para PCNA (p < 0.001) en áreas viables de los tumores H69 extirpados de los ratones que consumieron Cps en comparación con los controles.

Se midió la actividad apoptótica de la Cps con ensayos de escisión de caspasa de lisado de tumor de ratones. En los lisados de tumores de ratones que recibieron Cps hubo un incremento muy pequeño de la apoptosis celular en comparación con los ratones control. Por lo tanto, los autores conjeturan que posiblemente la Cps inhibe el crecimiento de tumores principalmente al producir la detención del ciclo celular.

El análisis de Western blot del lisado de tumores mostró que los tumores H69 aislados de ratones tratados con Cps tenían niveles menores de ciclina E, TS, cdc25A y cdc6 en comparación con los de ratones control. Estas observaciones sugieren que el efecto antiproliferativo de la Cps se correlaciona con un descenso en los niveles de genes en fase S sensibles a E2F in vivo.

Efecto de E2F-siRNA en la actividad antiproliferativa de la capsaicina

Se valoraron los efectos de E2F1-6 en la actividad antiproliferativa de la Cps mediante la metodología siRNA. Se observó que el E2F4-siRNA revirtió el efecto antiproliferativo de la Cps en células H69 y DMS114, mientras que E2F1, E2F3, E2F5 y E2F6 – siRNA no tuvieron efecto sobre la actividad de la Cps. El análisis de Western blot mostró que la transfección de estos siRNA suprimen los niveles de proteínas E2F1-6, tanto en las células H69 como en las DMS114.

Los ensayos de BdrU mostraron que la transfección de E2F1-6 siRNA sin Cps no afecta la proliferación celular. Ello indica que los efectos de E2F-siRNA observados son específicamente mediados por la Cps. Los datos obtenidos fueron verificados con ensayos de PCNA-ELISA, con similares resultados.

La capsaicina promueve el reclutamiento de E2F4

Los datos señalados sugieren que E2F4 juega un rol vital en los efectos antiproliferativos de la Cps. Se realizaron ensayos ChIP para examinar la ocupación diferencial de la familia E2F de proteínas en los promotores proliferativos sensibles a E2F (ciclina E, TS, cdc25A, cdc6) sobre el tratamiento de la Cps en las células de CPCPH H69. Se encontraron altos niveles de E2F proliferativas (E2F1, E2F2 y E2F3) y bajos niveles de p130 en células H69 asociadas a promotores proliferativos. Al tratar dichas células con Cps se produce una disociación de las E2F proliferativas y un reclutamiento de la E2F4, que es represiva, y de p130. Estos datos sugieren que la Cps recluta selectivamente E2F4 y p130, y que reprime así la transcripción de los promotores proliferativos e inhibe la entrada en fase S en células de CPCPH.

Discusión

La disfunción de la vía E2F/Rb es característica de más del 90% de los cánceres de pulmón. Muchos estudios han indicado que la mayoría de los CPCPH contienen mutaciones en los genes supresores, como Rb, p130, p16, ciclina D1 y p53, situación que facilita el crecimiento tumoral y las metástasis. La actividad antiproliferativa de agentes nutricionales como la Cps podría estar dada por su efecto sobre el ciclo celular.

La actividad antiproliferativa de la Cps no ha sido estudiada en CPCPH. El presente estudio mostró por primera vez que la Cps ejerce su efecto antiproliferativo en células de CPCPH, tanto en cuatro líneas de cultivos celulares como en modelos in vivo (CAM y modelos de ratones desnudos). La Cps no produjo malestar, toxicidad ni pérdida de peso en los ratones, por lo cual podría ser un tratamiento potencial para el manejo del CPCPH.

La mayoría de los estudios que evaluaron la Cps sugirieron que sus efectos antiproliferativos se debían a un mecanismo de apoptosis; sin embargo, los resultados del presente estudio demostraron que este agente nutricional produce la detención del ciclo celular en G1 de forma dependiente de la concentración, similar a lo observado en otros estudios realizados en células de otros cánceres.

Otro mecanismo involucrado en la actividad antiproliferativa de la Cps es la regulación de cdKs, p21 y p53 en las células evaluadas. Sin embargo, no existen estudios que hayan examinado su rol sobre la familia de transcriptores E2F. La investigación actual exploró la contribución de esta familia de transcriptores en los efectos sobre el crecimiento de las células de CPCPH. E2F1, E2F2 y E2F3 son promotores y E2F4, E2F5 y E2F6 son represores. La Cps inhibe la proliferación del CPCPH a través de E2F4, es decir que el efecto represor de E2F4 está mediado por Cps. La ablación de los niveles de E2F4 por dos siRNA independientes revierten los efectos antiproliferativos de la Cps. Además, la detención del crecimiento inducida por la Cps se asoció con un descenso en la expresión de los genes objetivo de E2F: ciclina E, TS, cdc25A y cdc6. El análisis de cromatina IP (ChIP) de células de CPCPH demostró que el tratamiento con Cps disminuye el reclutamiento de los E2F activadores y aumenta el reclutamiento del E2F4, que es represor.

Diversos estudios han involucrado a la vía E2F4/p130 en el crecimiento y la progresión del cáncer de pulmón. Los agentes nutricionales como la Cps reclutan la vía E2F4/p130 para ejercer su efecto antiproliferativo en las células de CPCPH. Tomados en conjunto, los datos de la presente investigación sugieren que la Cps posee una potente actividad antiproliferativa en células de CPCPH a través de la regulación de factores de transcripción de la familia E2F. Los resultados obtenidos incrementan la posibilidad de que agentes nutricionales como la Cps puedan ser de utilidad para el tratamiento del CPCPH.

Conclusiones

La capsaicina mostró una potente actividad antiproliferativa contra las células del CPCPH y su efecto está mediado por la vía de E2F4. Las aberraciones en la vía del E2F son características del CPCPH, por lo tanto, agentes nutricionales como la Cps, que tienen como blanco la vía del E2F, pueden representar nuevos caminos para el tratamiento de malignidades letales, como el CPCPH.

Especialidad: Bibliografía - Oncología