Participación del Ácido Hialurónico de Bajo Peso Molecular en la Diferenciación Osteoclástica

• TITULO : Participación del Ácido Hialurónico de Bajo Peso Molecular en la Diferenciación Osteoclástica
• AUTOR : Ariyoshi W, Takahashi T, Nishihara T y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Mechanisms Involved in Enhancement of Osteoclast Formation and Function by Low Molecular Weight Hyaluronic Acid
• CITA : Journal of Biological Chemistry 280(19): 18967-18972, May 2005
• MICRO : Los compuestos de ácido hialurónico de bajo peso molecular, al unirse al receptor CD44, promueven la diferenciación de los monocitos RAW 264.7 a células de características osteoclásticas, que participan en la activación de los mecanismos subyacentes a dicho proceso, que involucran a RANK, TRAP y las quinasas c-Scr, ERK y p38 MAPK.

Introducción

El ácido hialurónico (AH) se encuentra en altas concentraciones en el tejido conectivo, el cartílago, la piel, el humor vítreo y el tejido del cordón umbilical. Este polisacárido de cadena larga (dímeros de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina) se encuentra en mayor abundancia (0.5 a 4 mg/ml) en el líquido sinovial de las diartrosis. En este sentido, las alteraciones en su síntesis y degradación se traducen en cambios en su estructura molecular (compuestos de bajo peso molecular [LMW-HA, por su sigla en inglés]) y su disminución en el líquido sinovial, característico de cuadros clínicos como la artritis reumatoidea y la artrosis. Estas afecciones presentan un mayor desgaste en el cartílago articular, el hueso subcondral y el tejido conectivo de la membrana sinovial, debido a la eficacia reducida del líquido sinovial en amortiguar el estrés mecánico. En contraposición, las especies de alto peso molecular (HMW-HA, por su sigla en inglés) pueden promover la síntesis de AH en los sinoviocitos fibroblásticos e interactuar con el cartílago articular impidiendo su deterioro. Asimismo, se ha observado en condrocitos bovinos que el AH reduce la degradación de la matriz cartilaginosa, estimulando la síntesis de TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1). Por otra parte, el AH regula la resorción ósea mediante su unión al receptor CD44 en la superficie celular. Es importante destacar que, el AH de bajo peso molecular podría, asimismo, participar en la génesis de los osteoclastos inducida por el receptor activator of NF-kappaB ligand(RANKL).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la participación de los compuestos de AH de diferentes pesos moleculares en la diferenciación osteoclástica inducida por RANKL.

Métodos

Se procedió a realizar cultivos de células RAW 264.7 (monocitos de ratón), en una densidad de 5 x 102 por pocillo en placa de 96 pocillos (excepto en el ensayo de resorción ósea), en presencia de RANKL (40 ng/ml) y de especies de AH (100 µg/ml [excepto en el ensayo de diferenciación ósea: 1.56 a 100 µg/ml]) de diferentes pesos moleculares (péptidos de 4 y 12 aminoácidos [aa], 8 KDa y 2000 KDa). En estos cultivos se evaluó la diferenciación a osteoclastos, mediante la marcación con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, tartrate-resistant acid phosphatase), y el ensayo de la actividad TRAP y de resorción ósea (crecimiento por 14 días en placas cubiertas por películas de fosfato de calcio). De manera de establecer el efecto de la inhibición de la actividad de la enzima p38 proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK, mitogen-activated protein kinase) en la diferenciación osteoclástica y la actividad TRAP, los cultivos inducidos por RANKL fueron tratados con SB203580 (10-7, 10-6 y 10-5 M) inhibidor selectivo de dicha enzima. Las células con actividad TRAP que presentaban 3 o más núcleos, se clasificaron en células similares a los osteoclastos (OCL). De esta forma, la actividad TRAP se evaluó en los sobrenadantes de células resuspendidas en PBS, resultantes de 3 ciclos de congelación y descongelación, provenientes de los cultivos sometidos a los distintos tratamientos por un período de 6 días. Por otra parte, se determinó mediante Western blot la presencia de c-Src (tirosina quinasa), ERK(extracelular signal-regulated kinase), fosfo-ERK, p38 MAPK, fosfo-p38 y RANK en los lisados celulares provenientes de cultivos (105 células por pocillo de placa de 6) inducidos por RANKL y tratados alternativamente con AH, SB203580 (10-6 M) o BRIC 235 (anticuerpo monoclonal bloqueante de CD44) (5 µg/ml).

En el análisis estadístico se utilizó la prueba de la t de Student para muestras independientes, aplicando el método Bonferroni para la corrección de comparaciones múltiples. Un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Los compuestos de AH de diferentes pesos moleculares no afectaron la proliferación de las células RAW 264.7 en cultivo por distintos períodos (1 a 6 días). Por otra parte, los compuestos LMW-HA (4 aa, 12 aa y 8 kDa) promovieron la diferenciación de células RAW 264.7 a OCL, sólo en presencia del inductor RANKL, de manera que concentraciones más altas de LMW-HA (100 µg/ml) determinaron un mayor número de células multinucleadas con actividad TRAP (número máximo luego de 2 días de tratamiento). Dicha actividad superó 1.5 veces a la inducida por RANKL individualmente. No obstante, el compuesto HMW-HA (2000 KDa) no produjo efecto significativo en la diferenciación osteoclástica (no incrementó la actividad TRAP en las células). Por otra parte, la actividad de las OCL se estimó considerando el número de lagunas de resorción, observándose un aumento significativo en cultivos tratados con LMW-HA (4 aa, 12 aa y 8 KDa). Asimismo, el compuesto LMW-HA de 8 KDa activó la transcripción de RANK y promovió un mayor aumento de su expresión (cultivos de 6 a 72 horas) en ausencia o presencia de RANKL, respectivamente.

Con respecto al efecto del LMW-HA sobre las quinasas expresadas en los precursores osteoclásticos, la utilización de uno de estos compuestos (8 kDa), incrementó los niveles de proteína c-Src, cuya expresión se encontraba aumentada por acción de RANKL (máxima a las 72 h de tratamiento) y la fosforilación de ERK, la cual fue máxima luego de 30 min de la adición de RANKL (los niveles de ERK totales no cambiaron). Un efecto similar al producido en ERK se observó en la fosforilación de p38 MAPK al utilizar el AH de 8 KDa, la cual alcanzó su máximo luego de 60 min de la inducción con RANKL y un aumento adicional en presencia de dicho LMW-HA. No obstante, los niveles totales de p38 MAPK no fueron afectados por el tratamiento con AH. Es importante destacar que el HMW-HA (2000 KDa) no produjo aumentos en la fosforilación o en la expresión de las proteínas antes mencionadas. Por otra parte, la presencia del compuesto LMW-HA en ausencia del inductor RANKL no afectó a la fosforilación de ERK y de p38 MAPK y a los niveles de proteína c-Src.

La inhibición que ejerció SB203580 sobre la actividad de p38 MAPK, produjo una disminución significativa y dependiente de la dosis de dicho compuesto, de los OCL inducidos por el tratamiento de células RAW 264.7 con RANKL y el AH de 8 KDa. Por otra parte, BRIC 235, al bloquear los receptores de AH, CD44, inhibió el aumento en los niveles de las proteínas c-Src y RANK inducidos por LMW-HA.

Discusión

Los compuestos LMW-HA promueven la diferenciación de los monocitos RAW 264.7 y de células de la médula ósea de ratón (en estudios no publicados del laboratorio) a OCL inducida por RANKL, proteína perteneciente a la familia de factores de necrosis tumoral, el cual activa los mecanismos subyacentes a la génesis de los osteoclastos, al unirse a la proteína RANK. En dicho proceso, RANKL induce el aumento en la expresión de la proteína c-Src, la cual es fundamental para que el osteoclasto sea eficaz en la resorción ósea. En este sentido, se ha postulado que el mayor incremento en c-Src y en la actividad TRAP, inducido por los compuestos LMW-HA en el contexto del tratamiento con RANKL, favorecería a una mayor determinación celular al linaje osteoclástico, el cual sería susceptible de una diferenciación terminal hacia osteoclastos maduros mediada por RANKL. Por otra parte, en el proceso de diferenciación de los precursores de osteoclastos (inducido por RANKL), las especies LMW-HA produjeron un mayor aumento en la fosforilación de las quinasas ERK y p38 MAPK. Si bien en el presente estudio se utilizaron las células RAW 264.7, el incremento en la activación de p38 MAPK se observó, en estudios previos, en los precursores de la médula ósea tratados con RANKL. Asimismo, se estableció que la activación de la vía p38 MAPK estaba implicada en la resorción ósea promovida por la interleuquina-1 y el factor de necrosis tumoral alfa, en los huesos largos de los embriones de rata. La adición del inhibidor selectivo de dicha quinasa, inhibió la diferenciación osteoclástica de las células RAW 264.7, disminuyendo significativamente la actividad TRAP, demostrando la importancia fundamental de p38 MAPK en este proceso.

En el presente estudio se observó que los efectos de AH en la diferenciación osteoclástica de las células RAW 264.7, fueron mediados por su unión a receptores CD44 (el bloqueo del receptor inhibió sus efectos sobre c-Src y RANK).

En base a los resultados obtenidos se postula que la degradación de AH en la cavidad articular, estaría mediada por el receptor CD44 presente en los osteoclastos, produciendo de esta forma especies de AH de bajo peso molecular, las que promoverían la diferenciación a osteoclastos en células de los tejidos adyacentes.

Conclusión

Las especies de LMW-HA, al unirse al receptor CD44, promueven la diferenciación de los monocitos RAW 264.7 a células de característica osteoclástica (previamente inducida por la formación del complejo RANKL-RANK), participando en la activación de los mecanismos subyacentes a dicho proceso, que involucran a RANK, TRAP y las quinasas c-Scr, ERK y p38 MAPK.

Especialidad: Bibliografía - Traumatología