Descripción de una Técnica basada en Cromatografía por Intercambio Catiónico para Anticuerpos Monoclonales

• AUTOR : Lain B, Cacciuttolo M, Zarbis-Papastoitsis G
• TITULO ORIGINAL : Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography
• CITA : BioProcess International 7(5):26-34, May 2009
• MICRO : En este trabajo, se exponen los resultados de un método cromatográfico más económico que la cromatografía por afinidad como paso de obtención de anticuerpos monoclonales.

Introducción

La cromatografía de afinidad con proteína A es utilizada habitualmente como paso de captura de anticuerpos monoclonales, debido a su elevada pureza ya que solo el fragmento cristalizable (también llamado región Fc) de una inmunoglobulina IgG1 o IgG2 o la proteína de fusión contenida en este fragmento pueden unirse al ligando de la proteína A, por lo cual la presencia de impurezas se reduce de manera considerable. Sin embargo, los medios para la realización de este tipo de cromatografía tienen un costo elevado, de entre 9 000 y 12 000 dólares por litro, la proteína A que es filtrada debe ser removida al ser un inmunomodulador potente y los productos finales deben ser verificados mediante un ensayo de enzimas ligadas a inmunoabsorbentes (ELISA). Asimismo, requiere de instalaciones a prueba de incendios ya que, cuando se producen grandes cantidades, el medio debe conservarse en 20% v/v de etanol.

Para la producción del anticuerpo monoclonal adalimumab, se utiliza la cromatografía por intercambio de cationes (cation-exchange chromatography, CEX) como paso de captura. Este anticuerpo se une específicamente al factor de necrosis tumoral alfa, y su uso está aprobado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoidea. En este trabajo, los autores describen el desarrollo de un sistema de captura propio de elevada capacidad mediante el empleo de CEX con dos resinas que poseen una capacidad de unión dinámica superior a 100 gramos de proteína por litro de resina.

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron con un anticuerpo de tipo IgG1 y que estaba expresado en células PER.C6 producidas en recipientes de agitación con un volumen de trabajo de 4 y de 50 litros. Este anticuerpo tiene un punto isoeléctrico de 8.1. Los medios de cosecha se sometieron a diferentes procesos de filtración y se almacenaron a cuatro grados centígrados.

Con posterioridad, se realizaron cromatografías a diferentes escalas mediante el empleo de columnas de 6.36 ml, 77 ml y 286 ml en una estación de purificación. Estas columnas fueron empaquetadas con dos resinas: la GigaCap S-650M, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la Capto S, la cual se empaquetó en una columna de 1.6 × 2.9 cm (5.83 ml) de acuerdo con las recomendaciones del productor.

Todas las columnas se equilibraron en una solución amortiguadora (buffer) de 74 mM de acetato sódico con pH de 5.3 y conductividad de 4.5 mS/cm. Los anticuerpos monoclonales se extrajeron con una solución amortiguadora que contenía 120 mM de cloruro de sodio, y luego se efectuó la titulación hacia un pH neutral.

Las IgG1 purificadas se evaluaron mediante una electroforesis en gel con docecilsulfato sódico (SGS-PAGE) y se midieron los niveles de impurezas provocados por las proteínas de la célula huésped (HCP) con una prueba de ELISA específica para células PER.C6.

Resultados

Con el empleo de anticuerpos IgG1 parcialmente purificados, la capacidad de unión dinámica de la resina GigaCap S-650M fue superior a la observada con la Capto S (100 g del anticuerpo monoclonal/l contra 75 g/l, respectivamente), en condiciones cromatográficas idénticas. El pico de elución fue más amplio con la resina Capto S en comparación con el observado con la GigaCap S-650M, dato que concuerda con lo informado por Jackewit. Por ello, decidieron continuar sus experimentos con esta última resina.

Al efectuar diversas corridas cromatográficas en orden aleatorio con tres pH diferentes (4.9, 5.2 y 5.5) y dos niveles de conductividad (4.0 y 5.0 mS/cm), se observó que, a pH y conductividades más bajas, las cadenas livianas libres y las HCP se fijaron con mayor firmeza a la resina y redujeron la pureza del anticuerpo extraído, mientras que con los niveles más altos, la fijación de los anticuerpos a la resina en el CEX disminuyó, por lo cual la unión resultó menos firme y comenzaron a eludirse durante el proceso de lavado.

Sobre la base de la capacidad de unión, pureza del producto y reducción en las HCP, los autores determinaron que las condiciones óptimas fueron la presencia de un pH de 5.2 ± 0.2 y una conductividad de 4.5 ± 0.5 mS/cm, por lo cual establecieron un valor de pH de 5.3 y de conductividad de 4.5 mS/cm para experimentos futuros.

El anticuerpo se extrajo de la columna columna cromatográfica con una mezcla de soluciones amortiguadoras que contenían 1 M de cloruro de sodio. La concentración de sal resultante de esa mezcla fue cercana a 120 mM. Con posterioridad, evaluaron las condiciones de extracción o elución mediante un estudio en el que analizaron al pH y a la concentración de cloruro de sodio en la solución buffer del extracto, y detectaron un menor rendimiento con pH y concentraciones de cloruro de sodio más bajas, por lo que consideraron que al menos se requería de un pH de 5.2 y 110 mM de la sal para la extracción del anticuerpo con un rédito superior al 90%.

Sobre la base del rendimiento y de la pureza en relación con las HCP, la cual consideraron adecuada si era inferior a 6.5 μg HCP/mg de anticuerpo, se estableció una ventana operativa con un pH de 5.3 ± 0.2 y con una concentración de cloruro de sodio de 110 ± 15 mM para esta fase de elución.

Para demostrar la robustez de las condiciones cromatográficas desarrolladas, decidieron efectuar una prueba con columnas de cromatografía de 77 ml y con otra de 286 ml. Ambas se cargaron con 90 a 95 g/l de resina a un pH 5.3 y con una conductividad de 4.5 mS/cm, luego se efectuó un proceso de elución en una solución buffer que contenía 120 mM de cloruro de sodio, y con posterioridad se efectuó el ciclado de la columna de mayor capacidad tres veces, obteniéndose un rédito igual o superior al 95% en todos los casos y con una pureza calculada en el 99%, según el análisis mediante cromatografía por exclusión de tamaño.

Discusión y conclusiones

El objetivo propuesto por los autores en este trabajo fue desarrollar un sistema de captura de alta capacidad para anticuerpos monoclonales que pudiese reemplazar a la cromatografía tradicional por afinidad a la proteína A. El sistema desarrollado, añaden, puede ser empleado en combinación con otros métodos para la producción comercial de anticuerpos, como la cromatografía por intercambio aniónico, la cromatografía por columnas, la cromatografía por interacción hidrofóbica y modelos cromatográficos mixtos.

Pudieron demostrar que el medio GigaCap S-650M puede capturar una inmunoglobulina IgG1 monoclonal con una capacidad de unión dinámica igual o mayor a 90 g/l. Esta resina, además, puede operarse con tasas lineales de flujo de hasta 900 cm/h sin pérdida significativa en su capacidad. Además, determinaron tasas de recuperación superiores al 98%, pureza superior al 98%, y reducción en las HCP mayores al 95%. Estos resultados, señalan, son comparables a los obtenidos durante una fase de captura por afinidad, como la vinculada con la proteína A.

Asimismo, consideran que este nuevo sistema es de fácil ampliación y el costo de la resina empleada es de entre cuatro a seis veces inferior que el de las resinas utilizadas para la proteína A, por lo cual consideran que, si se toma en cuenta el costo y la capacidad de la resina, podría reducir los costos de producción de manera significativa.

Si bien este sistema basado en CEX puede requerir más trabajo por anticuerpo que la cromatografía tradicional para la producción de anticuerpos monoclonales, señalan que los datos aportan argumentos sólidos a tenerse en cuenta por parte de los fabricantes a gran escala de estos anticuerpos.

Ref : FARMA.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología