Relacionan al Uso de Dosis Bajas de Resveratrol con Efectos Cardioprotectores Asociados con Procesos de Autofagia

• AUTOR : Gurusamy N, Lekli I, Das D y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Cardioprotection by Resveratrol: A Novel Mechanism Via Autophagy Involving the mTORC2 Pathway
• CITA : Cardiovascular Research 86(1):103-112, Abr 2010
• MICRO : Las ventajas en la supervivencia celular miocárdica atribuidas al uso de dosis bajas de resveratrol podrían deberse, al menos de forma parcial, a la inducción de la autofagia mediada por la activación de las vías metabólicas que involucran al complejo mTORC2.

Introducción

Cuando concluye la diferenciación de los cardiomiocitos, se postula que la degradación celular (mediada por la autofagia, la vía de las ubiquitinas y proteosomas, o ambas) desempeña un papel importante en la homeostasis de las células cardíacas. La autofagia consiste en la degradación de los propios componentes de una célula por medio de la actividad de los lisosomas. En condiciones normales, este proceso permite la depuración a pequeña escala de proteínas, macromoléculas u organelas dañadas o envejecidas. De todos modos, se reconoce a la autofagia como un mecanismo vinculado con la muerte celular y con la progresión de la hipertrofia cardíaca compensadora a la insuficiencia cardíaca con disfunción sistólica. Este proceso parece incrementarse en presencia de sobrecarga de presión miocárdica, la cual constituye un factor de riesgo para la hipertrofia y la insuficiencia cardíacas. No obstante, la autofagia representa un mecanismo de protección miocárdica en caso de lesiones por isquemia-reperfusión (LIR), mientras que el precondicionamiento isquémico parece inducir también la autofagia cardíaca. Se destaca que el resveratrol (una fitoalexina polifenólica presente en las uvas, el vino, los maníes y otros productos de origen vegetal) puede preacondicionar al miocardio isquémico mediante vías de señalización de oxidorreducción. Sobre la base de los resultados de estudios previos efectuados por los autores, se presentan en este análisis los efectos del resveratrol en relación con la inducción de la autofagia cardíaca.

Métodos

Se seleccionaron ratas macho de entre 250 y 300 g de peso, que se alimentaron en forma libre hasta el inicio de la experiencia. Se administró a los animales una dosis predefinida de resveratrol (2.5, 25 o 100 mg/kg/día) durante 10 días. Por otra parte, se inyectaron 15 µg/kg de wortmanina por vía intraperitoneal unos 30 minutos antes de la exéresis cardíaca. Los corazones aislados se evaluaron en modelos clásicos y de funcionamiento con la aplicación de los dispositivos de perfusión de Langendorff, con estimación de los parámetros funcionales iniciales y experimentales. Se reunieron además muestras de ventrículo izquierdo para su evaluación por microscopia electrónica de transmisión y recuento de células en fase de apoptosis.

Por otra parte, se cultivaron en medios apropiados líneas celulares de mioblastos cardíacos de rata pretratadas con rapamicina, wortmanina y 3-metil-adenina. Se incorporó a los medios de cultivo una dosis de 0.1, 1 o 100 µM de resveratrol antes de efectuar una experiencia de hipoxia y reoxigenación. En estas líneas celulares se efectuó además una transfección con ARN pequeño de interferencia de la proteína Rictor o bien con ARN de control. Las células sometidas a hipoxia y reoxigenación se marcaron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra la proteína LC3-II para su evaluación por microscopia confocal. Se determinó en estos medios de cultivo tanto la supervivencia como la letalidad celular.

Todos los datos reunidos se procesaron con pruebas estadísticas específicas que incluyeron la corrección de Bonferroni en los casos de análisis unidireccional de la varianza. Se definió como significativo un valor de p < 0.05.

Resultados

La exposición de los medios de cultivo celular a 30 minutos de hipoxia con una etapa de reoxigenación posterior de 1 h se asoció con la inducción de autofagia. Asimismo, el tratamiento con dosis bajas de resveratrol (0.1 y 1 µM) sucedido por la presencia de hipoxia y reoxigenación provocó una inducción acentuada de este fenómeno, confirmada por un incremento de la expresión de la proteína de membrana LC3-II. De la misma manera, se verificó un aumento del recuento de las vacuolas de autofagia en un análisis de espectrofluoroscopia. Estos resultados se corroboraron mediante la evaluación con microscopia confocal de fluorescencia.

De todos modos, la exposición a dosis elevadas de resveratrol (100 µM) se asoció con una reducción de la magnitud del proceso de autofagia. El tratamiento con rapamicina, un inhibidor del receptor mTOR vinculado con la inducción de autofagia, no se relacionó con un incremento significativo de este fenómeno en comparación con la aplicación aislada de dosis bajas de resveratrol (1 µM). Sin embargo, la exposición a los inhibidores de la autofagia (wortmanina, 3-metiladenina) se correlacionó con una inhibición significativa del proceso de autofagia inducida por esas dosis bajas de resveratrol.

En este contexto, los investigadores agregan que, en el marco de la autofagia inducida por dosis bajas de resveratrol, la supervivencia celular se incrementó significativamente tras la exposición a hipoxia y reoxigenación. El incremento de la dosis aplicada de resveratrol provocó en cambio una disminución leve en esta tasa de supervivencia. Del mismo modo, los efectos de las dosis bajas de esta sustancia sobre la supervivencia celular se redujeron en presencia de un tratamiento previo con los inhibidores de la autofagia. En coincidencia, la exposición a dosis bajas de resveratrol se correlacionó con menores niveles de mortalidad celular, los cuales se reconocieron en función de una menor actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH). Por el contrario, el tratamiento con 3-metiladenina y wortmanina incrementó la liberación de LDH en comparación con el uso de dosis bajas de resveratrol, como equivalentes de una mayor incidencia de letalidad celular.

De modo paralelo, los parámetros funcionales cardíacos (presión efectuada por el ventrículo izquierdo, flujo aórtico y otras variables derivadas) mejoraron de forma significativa durante el período de reperfusión de 2 h en los corazones de los animales expuestos a dosis bajas de resveratrol (2.5 mg/kg/día) en comparación con los ejemplares de control. En cambio, estos efectos se atenuaron con el uso de dosis altas de resveratrol (100 mg/kg/día) o de wortmanina. Se demostró que la terapia con 2.5 mg/kg/día de resveratrol durante 10 días indujo el proceso de autofagia por medio de la estimulación de las proteínas LC3-II y beclina-1, así como mediante el aumento del cociente LC3-II/LC3-I. En las imágenes obtenidas por microscopia electrónica de transmisión se comprobó un incremento en el recuento de autofagosomas de doble membrana en las biopsias cardíacas de los animales que habían recibido dosis bajas de resveratrol. La cantidad de estas organelas se correlacionó de manera positiva con la expresión de la proteína LC3-II en el miocardio.

Además, el porcentaje de elementos celulares en fase de apoptosis se correlacionó de forma inversa con la inducción de autofagia a nivel miocárdico. De este modo, en presencia de altos índices de autofagia por exposición a dosis bajas de resveratrol, la magnitud de la apoptosis fue mínima. De la misma manera, el tratamiento con esta molécula se vinculó con una regulación diferencial del receptor mTOR, con incremento de su fosforilación en el residuo 2481 de serina y reducción del mismo proceso a nivel del residuo 2448 del mismo aminoácido. En cambio, la utilización de inhibidores de la autofagia se asoció con la inhibición de ambos procesos de fosforilación. Dado que el receptor mTOR forma 2 complejos funcionales diferentes (mTORC1 y mTORC2), los expertos llevaron a cabo un subanálisis de la activación de la quinasa p70s6 (uno de los objetivos de la actividad del complejo mTORC1). Se observó que esta enzima elevaba su actividad durante la fase de hipoxia y reoxigenación, pero sus efectos se redujeron en forma dependiente de la dosis de resveratrol administrada. Mientras que la rapamicina abolía la actividad de esta enzima en forma completa, los inhibidores de la autofagia reducían su acción de forma parcial.

En cambio, se observó que la proteína Rictor (el principal componente del complejo mTORC2) se inducía sólo en presencia de dosis bajas de resveratrol en un modelo de hipoxia y reoxigenación. En cambio, la exposición a estos procesos por sí sola o el uso de dosis altas de resveratrol no se asociaron con la inducción de esta molécula. Los investigadores recuerdan que la proteína Rictor parece activar la supervivencia celular por medio de la fosforilación del residuo de serina del mTORC2 en posición 473, con activación de la proteína quinasa B.

Discusión y conclusiones

Los expertos aseguran que, en función de los resultados obtenidos, las dosis bajas de resveratrol se asocian con la inducción de la autofagia, un incremento de la supervivencia celular y una reducción en la tasa de letalidad de las células cardíacas. Estos fenómenos se correlacionan con un efecto cardioprotector ante la presencia de LIR. Asimismo, la administración de dosis bajas de resveratrol se vincula de modo específico con la inducción de la proteína Rictor, un componente del complejo mTORC2, con inhibición del mTORC1 durante la estimulación de la autofagia.

Se señala que la autofagia es un proceso de autodepuración preparado para la remoción de moléculas u organelas dañadas, por lo cual representa un mecanismo alternativo a la degradación por proteosomas. Si bien se consideró inicialmente a la autofagia como un componente de la muerte celular programada diferente a la apoptosis, este concepto se ha modificado, ya que se demostró que la autofagia puede vincularse también con la supervivencia celular. En los datos obtenidos en este análisis, las dosis bajas de resveratrol se asociaron con autofagia cardíaca y con un incremento de la supervivencia en cultivos de mioblastos, mientras que la inhibición del proceso de autofagia se vinculó con la reducción de los efectos cardioprotectores atribuidos al resveratrol. En cambio, las dosis elevadas de esta molécula se vincularon con menores niveles de autofagia y con la inducción de muerte celular.

Por otra parte, se observó una inducción de la proteína Rictor, un componente del complejo mTORC2, ante la exposición a dosis bajas de resveratrol. Esta proteína provoca la fosforilación de la proteína quinasa B en el residuo 473 de serina, con regulación de la supervivencia, el crecimiento, la proliferación y el metabolismo celulares. Los resultados obtenidos en este análisis permiten presumir que las ventajas en la supervivencia celular atribuidas al uso de dosis bajas de resveratrol se deben, al menos de forma parcial, a la inducción de la autofagia mediada por la activación de las vías que involucran al mTORC2.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología