Demuestran la Eficacia de los Nuevos Inhibidores de las Beta Lactamasas de Clase D

• AUTOR : Drawz S, Bethel C, Bonomo R y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Penicillin Sulfone Inhibitors of Class D Beta-Lactamases
• CITA : Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(4):1414-1424, Abr 2010
• MICRO : La molécula JDB/LN-1-255, obtenida por sustitución de un grupo sulfona en el carbono 2, parece representar un nuevo inhibidor de las beta-lactamasas de amplio espectro, con efectos inhibitorios sobre las enzimas de clase D y actividad sobre las penicilinasas, las carbapenemasas y las beta-lactamasas de espectro extendido.

Introducción

La complejidad de las beta-lactamasas se atribuye a la ubicación de diferentes aminoácidos en el sitio activo de estas enzimas. Las OXA-beta-lactamasas son un grupo de enzimas de clase D que se asemejan en su estructura a las proteínas de unión a la penicilina de tipo C. Las OXA-beta-lactamasas se expresan en patógenos intrahospitalarios de difícil tratamiento, como Pseudomonas aeruginosa y especies de Acinetobacter., que resultan resistentes a penicilinas, cefalosporinas y carbapenémicos. Los genes bla_OXA que codifican estas enzimas pueden localizarse en el cromosoma, los plásmidos o en integrones y se caracterizan por ser inducibles.

Se describieron más de 140 OXA-beta-lactamasas. Este creciente número ha motivado interés tanto en la comprensión de los mecanismos de resistencia bacteriana como en la elaboración de inhibidores eficientes. Las OXA-beta-lactamasas se inhiben en forma mínima por la acción de las actuales combinaciones de beta-lactámicos y de inhibidores de las beta-lactamasas (IBL). En el proceso de investigación para la creación de nuevos IBL, se han diseñado moléculas en las cuales se sustituyen los residuos alquilideno de estas moléculas en los carbonos 2 y 3 por radicales sulfona.

Materiales y métodos

Se clonó el gen bla_OXA-1 a partir del plásmido R_GN238 en un vector específico. Este plásmido modificado se mantuvo en un cultivo de la cepa DH10B de Escherichia coli. Por otra parte, se efectuó la amplificación de un plásmido que contenía al gen bla_OXA-24/40 para su posterior inserción en otro cultivo similar, con el objetivo de expresar y purificar la beta-lactamasa OXA-24/40.

Ambas beta-lactamasas se produjeron por medio de la inducción de las cepas de E. coli que contenían uno u otro plásmido. Las enzimas se purificaron mediante su aislamiento por técnicas de enfoque isoeléctrico. Se determinaron en estas moléculas y en otras beta-lactamasas los parámetros de cinética enzimática, incluidas la velocidad máxima (V_MÁX) y la constante de Michaelis-Menten (K_m). La inhibición de las beta-lactamasas, la susceptibilidad de las colonias bacterianas y la modelación molecular se evaluaron mediante la combinación de espectroscopia de masa o de diferencia ultravioleta, según el modelo elegido.

Resultados

Se logró una homogeneidad superior al 95% en la purificación de las beta-lactamasas OXA-1, 10, 14, 17 y 24/40. Los elevados niveles de la constante de actividad (k_CAT) de la OXA-1 para la oxacilina se expresaron en una alta eficacia catalítica (k_CAT/K_m = 19 ± 1 µM^-1 s^-1), mientras que la eficacia para la ampicilina fue 3 veces menor. Dado que el perfil de sustratos de las OXA-10, 14, 17 y 24/40 se había descrito con anterioridad, los autores destacan que se hizo énfasis en el comportamiento de la nitrocefina, elegida como sustrato de referencia. La eficacia catalítica para este antibiótico en relación con las OXA-beta-lactamasas de espectro extendido (OXA 10, 14 y 17) y para la OXA-24/40 osciló entre 4 ± 0.1 y 9.6 ± 0.3 µM^-1 s^-1. En estas experiencias, no se demostró una cinética bifásica para las OXA en relación con los sustratos elegidos, lo que se atribuye a la utilización de concentraciones nanomolares con una constante de disociación relativamente baja.

Por otra parte, los IBL obtenidos por sustitución de grupos sulfona en los carbonos 2 y 3 se asociaron con menores constantes de disociación para la unión entre los sustratos y estos inhibidores (K_i) en comparación con el ácido clavulánico y el tazobactam. Las determinaciones de la actividad de la molécula JDB/LN-1-255 (obtenida por una sustitución de sulfona en el carbono 2) se asociaron con la inactivación de la OXA-1 que no difirió significativamente de la descrita para el tazobactam, aunque la menor K_i de esta nueva molécula se vinculó a un aumento de hasta 89 veces en su eficacia como inhibidor enzimático. Tanto este producto como la molécula JDB/ASR-II-292 (también obtenida por sustitución en el carbono 2), se asociaron con menores índices de K_i en comparación con el ácido clavulánico y el tazobactam. Para ambos derivados de las sulfonas, los K_i se encontraban en niveles nanomolares o en el límite inferior del intervalo micromolar, tanto para la OXA-24/40 como para la OXA-10 y la OXA-17.

Se destaca que los IBL con bajas tasas de K_i y de número de recambio sólo resultan útiles en la práctica clínica si pueden evitar la catálisis de los antibióticos beta-lactámicos en presencia de beta-lactamasas. Sobre la base de la cinética enzimática demostrada para la JDB/LN-1-255, se efectuó un análisis comparativo entre esta molécula y el tazobactam en un modelo in vitro. Para la cepa de E. coli portadora del plásmido RGN238 blaOXA-1, la asociación de piperacilina y 4 µg/ml de JDB/LN-1-255 se vincula a una mayor potencia en comparación con la combinación con una concentración similar de tazobactam.

Las experiencias de modelación molecular con sustratos apropiados (oxacilina, cefaloridina) para la OXA-1 permitieron una mejor caracterización de la afinidad de la molécula JDB/LN-1-255 con el sitio activo de esta beta-lactamasa. En este modelo, se comprobó una interacción del grupo carboxilo del carbono en posición 3 de la JDB/LN-1-255 con los residuos de serina en posición 115 y de tironina en posición 213 en la OXA-1. Esta conformación se asocia con un mejor acoplamiento del carbono 2 de la molécula JDB/LN-1-255 con el espacio ofrecido entre los residuos de glicina en posición 113 y de leucina en posición 259. Se presume que las interacciones hidrófobas entre los residuos de valina o leucina y el anillo piridilo pueden contribuir a una mayor afinidad del inhibidor con la enzima.

Discusión y conclusiones

En el presente análisis se comparó la actividad de los miembros de una nueva familia de IBL obtenidos por sustitución en el carbono 2 o 3 con un grupo sulfona con los efectos del ácido clavulánico y el tazobactam sobre OXA-beta-lactamasas. Estas enzimas de clase D se diferencian en su secuencia primaria y en su estructura de otras beta-lactamasas de clases A y C. Dado que las OXA-beta-lactamasas se expresan en gérmenes multirresistentes intrahospitalarios, la necesidad de comprender la cinética de estas enzimas resulta de gran importancia para la elaboración de los IBL.

El objetivo de este ensayo consistió en la identificación de inhibidores con capacidad para inactivar todas las OXA-beta-lactamasas, incluidas las penicilinasas (OXA-1), las beta-lactamasas de espectro extendido (OXA-10, 14 y 17) y las carbapenemasas (OXA-24/40). Los compuestos con sustitución del carbono 2 por un grupo sulfona, como JDB/LN-1-255, se asocian con una inhibición de la OXA-1 con bajos niveles de K_i. Estas moléculas resultan más eficaces que aquellas que presentan una sustitución en el carbono 3 y se relacionan con menores índices de Ki en comparación con el ácido clavulánico y el tazobactam. Asimismo, tanto JDB/LN-1-255 como JDB/ASR-II-292 se vincularon a valores reducidos de K_i en relación con las beta-lactamasas de espectro extendido. Además, ambas moléculas se correlacionaron con efectos sobre la OXA-24/40, lo cual es destacado por los autores en virtud de que el perfil del sustrato de esta enzima (los carbapenémicos) es diferente del de las penicilinasas o el de las beta-lactamasas de espectro extendido.

Entre estas moléculas, JDB/LN-1-255 se caracterizó por el menor nivel de K_i, mientras que se comprobó su actividad in vivo en términos de una reducida concentración inhibitoria mínima en cultivos bacterianos. En comparación con el tazobactam, este nuevo IBL se asocia con la optimización significativa en la tasa de recambio y en la capacidad inhibitoria sobre OXA-1. En presencia de inhibidores irreversibles de las serina-beta-lactamasas, la eficacia se determina mediante la evaluación combinada de una serie de factores, con el reconocimiento del inhibidor, la velocidad y eficacia de la acilación y la estabilidad hidrolítica del complejo acil-enzima. Las beta-lactamasas de clase D no son inhibidas por los IBL disponibles, como el ácido clavulánico o el tazobactam, a diferencia de lo observado con las beta-lactamasas de tipo A. Estos IBL convencionales requieren, ya sea la isomerización de un producto intermedio, o bien la intercepción de ese metabolito intermedio a nivel de una cadena lateral nucleofílica. En consecuencia, en uno u otro caso, es necesaria cierta capacidad de la propia enzima (inhibición basada en el mecanismo enzimático). Por el contrario, la molécula JDB/LN-1-255 se vincula a un área nucleofílica propia, representada por el nitrógeno de un anillo piridínico, aunque aún no se conocen los detalles del proceso de acilación con certeza.

Así, la molécula JDB/LN-1-255, obtenida por sustitución de un grupo sulfona en el carbono 2, parece representar un nuevo IBL de amplio espectro, con efectos inhibitorios sobre las beta-lactamasas de clase D y actividad sobre las penicilinasas, las carbapenemasas y las beta-lactamasas de espectro extendido.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología