Avances en el Diagnóstico Basado en Micromatrices de ADN

• AUTOR : Beaudet A, Belmont J
• TITULO ORIGINAL :Array-Based DNA Diagnostics: Let the Revolution Begin
• CITA:Annual Review of Medicine 59113-129, 2008
• MICRO : En este artículo se describen las técnicas más modernas de genotipificación, secuenciación y análisis de variaciones del número de copias de ADN y su utilidad en la clínica y en la investigación.

Introducción

Con el aumento de la disponibilidad de las micromatrices de ADN, los estudios genómicos con fines diagnósticos y de investigación se han vuelto más accesibles. Actualmente existen distintos métodos para detectar las variaciones del ADN, como la hibridación genómica comparativa (HGC) basada en matrices, en la que se requiere una muestra control para la comparación, y otras técnicas que permiten determinar el número relativo de copias de una región del genoma. Estas últimas técnicas, que permiten cuantificar las diferencias numéricas en muestras de ADN humano, se describen como técnicas para el análisis de micromatrices cromosómicas (AMC).

Para las técnicas de HGC se suelen utilizar cromosomas bacterianos artificiales, aunque en los últimos años se han creado plataformas con oligonucleótidos. Para las técnicas de AMC, en cambio, se utilizan micromatrices originalmente creadas para la identificación de polimorfismos de una única base nucleotídica (PUBN), modificadas para permitir el análisis del número de copias.

Arquitectura del genoma

Recién en los últimos años se ha reconocido la gran variabilidad en el número de copias existentes en el genoma humano.

Los trastornos genómicos son fenotipos clínicos causados por alteraciones en el número de genes o por la desregulación de uno o más genes que provienen de rearreglos del genoma. Las secuencias repetitivas con un bajo número de copias (SRBNC) son secuencias del genoma de una longitud considerable que suelen ser idénticas en un 98% a 99%. Estas pueden contener uno o más genes funcionales intactos y son las causantes de deleciones, duplicaciones e inversiones del genoma. Las variantes del número de copias (VNC) suelen presentarse dentro de regiones flanqueadas por SRBNC, por lo que su identificación permite detectar regiones del genoma particularmente propensas a las deleciones y las duplicaciones.

Significado funcional de las VNC

Algunas VNC representan alteraciones genómicas con penetrancia elevada o completa, que pueden comprometer un único gen o distintos genes que influirán sobre el fenotipo. Se cree que la mayoría de las VNC no causan alteraciones del fenotipo, aunque algunas influyen sobre regiones del genoma con penetrancia incompleta por lo que los portadores, a pesar del desarreglo genómico, son asintomáticos. En la actualidad se investiga el papel de las VNC en enfermedades de etiología compleja, en las que estas variaciones podrían contribuir a las alteraciones del fenotipo. Es probable que las VNC también expliquen las variaciones fenotípicas de la población normal, como diferencias en la pigmentación cutánea y otros rasgos.

Metodología

Existen diferentes métodos para evaluar las VNC. Las matrices con oligonucleótidos disponibles comercialmente son plataformas con 20 a 80 nucleótidos que permiten analizar una región específica del genoma debido a que se pueden seleccionar matrices sin secuencias repetitivas. Además, permiten identificar variaciones que se producen en una sola de las cadenas del ADN. Las plataformas de oligonucleótidos que permiten detectar PUBN permiten identificar disomías de un progenitor, la pérdida de la heterocigosidad, la paternidad y al progenitor en el que se originó la deleción o la duplicación. Las plataformas que combinan la cuantificación del número de copias y la detección de PUBN permiten realizar estudios genómicos para identificar una mayor predisposición a padecer enfermedades originadas en alteraciones del genoma.

Las matrices utilizadas para las técnicas de HGC con cromosomas bacterianos artificiales se producen en laboratorios de investigación y su disponibilidad a escala comercial es menor que la de las plataformas de oligonucleótidos. Con estas técnicas se pueden obtener resultados a partir de secuencias cortas de ADN, pero como contienen secuencias repetitivas de ADN humano, se requiere de la Cot-1 DNA para inhibir la hibridización de las secuencias repetitivas, y aun así, es difícil lograr un adecuado ajuste de la señal.

La posibilidad de amplificación del genoma permite incrementar el número de análisis que se pueden realizar con una única muestra.

Aplicaciones en la investigación

Hasta el momento, las investigaciones se han centrado en el estudio del grado de variación del número de copias en el genoma, pero en el futuro, con la tecnología en elaboración, se podrá establecer el papel de las VNC en la evolución y la diversidad humanas y su relación con la predisposición a enfermedades. Ya se han descrito diferencias entre poblaciones africanas, europeas y asiáticas.

Se sabe que la haploinsuficiencia de un gen puede provocar un fenotipo distintivo con alta penetrancia y con variaciones en su expresión. Estos genes serían sumamente dependientes de la dosis. Muchos genes tendrían una sensibilidad intermedia a las variaciones y el efecto dependería del genotipo de otros loci y del medio, por lo que habría diferencias notables en el fenotipo de los individuos sintomáticos para una cierta duplicación o deleción.

Aplicaciones clínicas

El análisis del número de copias ya se utiliza para la detección de mutaciones asociadas con el retraso mental, los retrasos del desarrollo y otros síndromes. Con las técnicas de análisis del número de copias por matrices se puede detectar un espectro de mutaciones mayor que con la evaluación del cariotipo con Giemsa. Estas técnicas son particularmente útiles para la detección de duplicaciones y son mucho más económicas que la hibridización in situ por fluorescencia (FISH).

La frecuencia de la detección de alteraciones depende de los estudios citogenéticos realizados, de la heterogeneidad de la población y de la complejidad de las matrices utilizadas. Los autores estiman que con las técnicas de análisis del número de copias por matrices se detectarán entre el 12% y el 18% de las alteraciones presentes en los niños con múltiples trastornos congénitos o con retraso mental o del desarrollo, mientras que con el cariotipo, sólo se detectarían entre el 3% y el 5%.

Existen controversias acerca de la conveniencia de utilizar matrices que analizan regiones del genoma predeterminadas, que se sabe que están asociadas con las alteraciones y que permiten también la detección de alteraciones en individuos con cariotipos normales o matrices de traslape.

Las técnicas para el estudio de VNC predeterminadas suelen permitir un análisis más detallado de las regiones subteloméricas y las que rodean al centrómero, y se suelen centrar en VNC de regiones que se sabe causan alteraciones del fenotipo con una penetrancia del 100%. Actualmente, la utilización de técnicas de análisis con matrices predeterminadas para el diagnóstico en niños con múltiples discapacidades puede considerarse como evidencia de una evaluación de buena calidad.

Cuando se realizan análisis del número de copias con matrices es frecuente encontrar VNC de las cuales no se tiene mucha información. Para la interpretación de estos hallazgos se debe considerar que si la VNC no está presente en el genoma de los padres, es muy probable que sea la causa de las alteraciones, mientras que si se encuentra en una región de mucho polimorfismo en la población general, es poco probable que sea la causa del trastorno. Por último, también se debe tener en cuenta el tamaño de la deleción o la duplicación, ya que las VNC que causan alteraciones suelen ser más extensas que las benignas. El contenido genético de la región también puede ayudar a determinar su implicancia clínica. Es más probable que las deleciones y duplicaciones que comprometen varios genes sean causantes de enfermedad frente a aquellas que comprometen un número pequeño de genes.

Las matrices de traslape permiten un análisis más amplio y, por lo tanto, facilitan la detección de las alteraciones causantes del trastorno. Sin embargo, también es más frecuente que con estas técnicas se identifiquen VNC benignas, que son variantes comunes en la población. Sin embargo, si se detectan VNC menos frecuentes, puede ser necesario evaluar el genoma paterno para determinar si son mutaciones de novo o heredadas.

Puede ser más rentable comenzar los estudios con la utilización de matrices predeterminadas y utilizar las de traslape en una segunda instancia, cuando las primeras dan resultados normales. En general, cuando en el análisis de técnicas con matrices predeterminadas se encuentran alteraciones, se debe analizar el genoma paterno.

Para el diagnóstico prenatal, las técnicas de análisis del número de copias con matrices son superiores al diagnóstico por la evaluación del cariotipo, ya que permiten detectar un número mayor de anormalidades.

Genotipificación de proceso de alto rendimiento de polimorfismos frecuentes

La genotipificación por matrices evita la necesidad de seleccionar genes candidatos en los estudios de asociación genética. Las pruebas de asociación directa analizan si una variante en particular se relaciona con una enfermedad comparando la frecuencia de su aparición en los individuos enfermos y en los controles. Ante la ausencia de una prueba de asociación directa, la relación entre polimorfismos adyacentes permite utilizar marcadores comunes como subrogantes de las variantes que causan la alteración del gen. La correlación entre polimorfismos adyacentes se denomina desequilibrio de ligamiento (DL), y en el proyecto HapMap se ha elaborado un mapa de alta resolución de DL con el que se han seleccionado los PUBN que permitirían detectar un elevado porcentaje de correlaciones genéticas. La disponibilidad del mapa de DL junto con la tecnología que permite obtener los marcadores genómicos posibilitan la realización de estudios de asociación genética, los que a su vez facilitan la identificación de asociaciones, independientemente del conocimiento previo de los genes o los mecanismos involucrados en la patogenia de una enfermedad.

Plataformas para análisis del genotipo

En la actualidad es posible realizar la genotipificación rápida de múltiples PUBN en forma precisa y con bajo costo. Estas matrices deben tener alta precisión para detectar variaciones de un único nucleótido.

Debido a la baja concentración molar de las secuencias únicas de ADN en el genoma humano, para la obtención de señales adecuadas para el análisis se requiere de técnicas de amplificación.

Las pruebas de amplificación genómica permiten la amplificación en paralelo de pequeños segmentos de ADN, los que luego son marcados e hibridizados a paneles de sondas de oligonucleótidos que son específicos para cada uno de los alelos del PUBN. Con la medición de la intensidad es posible obtener el genotipo, pero con este método el investigador no puede obtener datos acerca de otros PUBN no predeterminados.

Otra técnica alternativa para la detección de los productos específicos de cada alelo es la detección de cebadores específicos de alelos o de productos de una única base de extensión.

Resultados positivos en estudios de asociación genética

Desde que se comenzaron a realizar estudios de asociación en los que se analizaban regiones genéticas identificadas previamente por DL, se ha vuelto factible la detección de loci genéticos asociados con la aparición de enfermedades frecuentes. Con los estudios de DL, no sólo se identificaron los loci relacionados con la enfermedad, sino también la magnitud del efecto de cada uno de ellos y de otras características genéticas de la enfermedad. Asimismo, no sólo fue posible la identificación de genes asociados con enfermedades comunes, como la diabetes tipo 1, sino también enfermedades menos frecuentes como la enfermedad de Hirschprung.

Con la mayor posibilidad de identificar PUBN, se han podido detectar muchos de los que causan alteraciones en la función de las proteínas asociadas con la patogenia de distintas enfermedades. Gracias a la tecnología hoy disponible es posible realizar estudios de asociación genética sin necesidad de tener un conocimiento previo del impacto de un gen sobre una enfermedad.

Se ha demostrado que la fusión de estudios epidemiológicos con análisis genéticos permite identificar las variantes más comunes asociadas con una enfermedad determinada. Estos estudios se realizan en distintas etapas. En la primera, se efectúa un rastreo del genoma para identificar los loci con mayor probabilidad de asociarse con la enfermedad, que luego serán analizados con mayor detenimiento.

A partir de estos datos se infiere, en primer lugar, que existen mecanismos patogénicos clave para las distintas enfermedades, y que las variaciones genéticas que afectan a alguno de estos mecanismos pueden interactuar y producir un aumento del riesgo. En segundo lugar, dado que el riesgo asociado con la variación específica de un loci suele ser bajo, los estudios en los que se analizan estas variaciones deben ser lo suficientemente grandes como para lograr el poder estadístico necesario para establecer y validar asociaciones. En tercer lugar, los autores resaltan la importancia de realizar estudios genómicos no sesgados, con el objetivo de identificar variaciones no descritas con anterioridad. Por último, se debe considerar que la mayoría de PUBN identificados hasta el momento tienen una función reguladora, de modo que los análisis de sustitución de aminoácidos o de las secuencias de exones no permitirán detectar las alteraciones.

Genotipificación de proceso de alto rendimiento y análisis de mutaciones conocidas

Las plataformas para la genotipificación utilizadas para la detección de PUBN pueden ser adaptadas para la identificación de variantes genéticas más raras que influyen sobre la aparición de distintas enfermedades. Existen técnicas que permiten el análisis en simultáneo de miles de loci con la misma reacción. Asimismo, se han creado pruebas que permiten la identificación de mutaciones en genes específicos para utilizar en enfermedades con importante heterogeneidad genética; en tal sentido, los autores consideran que éstas podrían ser de gran utilidad para el diagnóstico y la identificación de portadores de enfermedades de herencia mendeliana.

Avances en la secuenciación de ADN en matrices

Actualmente se están investigando técnicas para aumentar el rendimiento y reducir el costo de la secuenciación de ADN. Estas técnicas obtienen las secuencias a medida que éstas son agregadas por la polimerasa. Una de las técnicas creadas utiliza la pirosecuenciación, reacción en la que se detecta la liberación de pirofosfato a medida que los nucleótidos se suman a un cebador de ADN hibridizado a partir de un templado de ADN. La ADN polimerasa se detiene ante la presencia de una base no complementaria y la síntesis se reinicia luego de la adición del siguiente deoxirribonucleótido (dNTP) complementario. Cuando la base se suma a la cadena de ADN se libera pirofosfato, que es detectado por amplificación. El instrumento de secuenciación controla el orden en que se adicionan los dNTP a la reacción y con la emisión de luz se logra decodificar la secuencia formada.

Una de las ventajas de la amplificación clonal es que permite resolver los problemas que surgen de la heterocigosidad.

Otra técnica para la secuenciación es la terminación reversible cíclica, en la que la secuencia de ADN se decodifica mediante el análisis de la adición de ciclos de bases a partir de un templado de ADN desconocido. Para esta técnica se utilizan nucleótidos terminadores de la secuencia marcados con material fluorescente, a los que luego de la detección de la señal se les remueve el grupo protector; esto permite la adición de un nuevo ciclo de bases.

En dos estudios recientes se demostró la utilidad de las técnicas más modernas de secuenciación, y aunque por el momento su aplicación en la práctica clínica es restringida, es probable que en el futuro cercano sea posible el análisis simultáneo de un número importante de genes o del genoma completo.

Especialidad: Bibliografía - Clínica Médica