Potencial Utilidad de las Enzimas Bacterianas para el Tratamiento de la Adicción a la Cocaína

• AUTOR : Brim R, Nance M, Woods J y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : A Thermally Stable Form of Bacterial Cocaine Esterase: A Potential Therapeutic Agent for Treatment of Cocaine Abuse
• CITA : Molecular Pharmacology 77(4):593-600, Abr 2010
• MICRO : Las mutaciones en esterasas bacterianas específicas para incrementar la termoestabilidad constituyen una alternativa promisoria para el tratamiento de la adicción a la cocaína.

Introducción

La adicción a la cocaína afecta a millones de individuos y se asocia con arritmias cardíacas, hipertensión arterial, necrosis hepática, enfermedades psiquiátricas y mortalidad. Las repercusiones económicas de la atención de estos pacientes representan una proporción importante de la inversión para el tratamiento de las adicciones en los Estados Unidos. De todos modos, no se dispone de terapias aprobadas por la FDA para el abuso de cocaína.

Los autores recuerdan que esta sustancia inhibe a los transportadores de las monoaminas, con un incremento de la estimulación adrenérgica y bloqueo directo de los canales del sodio. Estos procesos se vinculan a alteraciones cardíacas. Señalan que el uso de inhibidores de la acción antagonista de la cocaína sobre los transportadores de dopamina y serotonina no permite reducir el riesgo cardiovascular. Se ha intentado estimular el metabolismo de la cocaína, que consiste en la degradación de esta sustancia por la enzima endógena butiril-colinesterasa, cuyos productos finales son la metil-éster-ecgonina y el ácido benzoico. Pese a los resultados positivos de los modelos experimentales, la producción comercial de esta enzima no parece posible, como consecuencia de su bajo nivel de expresión y de la complejidad de los procesos postraslacionales.

En este contexto, los expertos recuerdan la existencia de cocaína esterasas bacterianas (COCE). Así, la enzima producida por la cepa MB1 de las especies del género Rhodococcus se vincula a menores tasas de alteraciones cardiovasculares y mortalidad en modelos de experimentación con roedores. Aunque la forma natural de esta COCE no puede utilizarse como un fármaco debido a su breve vida media, se identificó una forma mutante de esta molécula con una vida media más prolongada. Además, esta variante estable de COCE permite inhibir los efectos de refuerzo de la cocaína en sesiones de autoadministración de esta sustancia durante 1 hora, por lo cual se presume que la enzima puede degradar la cocaína de un modo lo suficientemente veloz para evitar esta acción de refuerzo.

En el presente ensayo, los autores describen las propiedades in vitro e in vivo de la variante COCE-L169K/G173Q, una forma termoestable con una semivida de 2.9 días a 37ºC.

Materiales y métodos

Se introdujeron mutaciones puntuales en la secuencia de la COCE por medio de un vector de expresión bacteriana con un protocolo modificado de mutagénesis. Tanto la forma natural como las mutantes se purificaron con métodos convencionales.

Para el análisis de la hidrólisis de la cocaína se llevó a cabo una cuantificación mediante espectrofotometría para concentraciones de 0.5, 2.5, 5, 12.5, 25, 50, 100 y 150 µM de esta sustancia. Se calcularon para ambas enzimas tanto la velocidad máxima (V_MÁX) como la constante de Michaelis (K_m).

Se seleccionaron roedores de laboratorio en los que se administró por vía intravenosa ya sea una COCE (1, 0.3, 0.1, 0.032 y 0.01 mg) o bien solución fisiológica, antes de la aplicación de una dosis intraperitoneal de cocaína (100, 180, 320, 560 o 1 000 mg/kg). La toxicidad inducida por la cocaína se evaluó por la aparición de convulsiones o letalidad.

En una segunda experiencia, se eligieron ratas a las cuales se les colocó un catéter venoso femoral bajo anestesia. A continuación, los ejemplares fueron entrenados de modo progresivo para responder a una inyección de 0.56 mg/kg de cocaína y evaluar las conductas de refuerzo. Una vez logrado el nivel de entrenamiento necesario, se elevó la dosis administrada a 0.1 mg/kg y se administró ya sea COCE-L169K/G173Q o solución fisiológica antes del uso de cocaína.

Todos los datos reunidos se procesaron con pruebas estadísticas específicas.

Resultados

Si bien en estudios previos se describió que la variante COCE-L169K se asociaba con una prolongación de hasta 33 veces en la vida media en comparación con la enzima natural, se describió en este análisis un incremento de la K_m asociado con un deterioro de su capacidad catalítica. Para compensar esta alteración, se apareó esta variante de la COCE con mutaciones simples para verificar si el aumento de la K_m podía corregirse o si la vida media podía extenderse por efecto sinérgico.

La COCE-L169K retuvo un 55% de su actividad enzimática después de un período de incubación de 24 horas a 37 ºC. La combinación de las variantes L169K y T172R se asoció con la producción de una variante con una menor V_MÁX y una mayor K_m en comparación con la enzima natural. La combinación de las variantes L169K y N197K se vinculó a la conservación de las propiedades farmacocinéticas de la enzima original, pero no se confirmó la presencia de actividad enzimática después de 24 horas.

Sin embargo, la combinación de las formas L169K y G173Q se vinculó a una prolongación de la vida media y a la conservación del 75% de la actividad enzimática después de 24 horas. A pesar de que la K_m fue alrededor de 4 veces mayor que la medida para la enzima natural, su valor se estimó en la mitad del correspondiente para la COCE-L169K. Esta asociación se caracterizó por una V_MÁX superior a la de las restantes mutantes identificadas. Además, la COCE-L169K/G173Q presentaba una vida media cercana a los 2.9 días a 37 ºC. Los expertos recuerdan que la estructura de las COCE presenta 3 dominios, los cuales contribuyen a la conformación del sitio activo. En la variante COCE-L169K/G173Q se describen mutaciones en la segunda hélice del dominio II y provocan nuevas interacciones entre los dominios I y II.

Por otra parte, la administración intraperitoneal de 180 mg/kg de cocaína provocó la muerte de todos los animales de experimentación. El tratamiento previo con COCE-L169K/G173Q se asoció con una modificación de la curva de respuesta en función de la dosis de cocaína. Se verificó que, incluso el uso de dosis muy bajas de la enzima, se relacionó con efectos sobre la dosis letal de cocaína en forma más acentuada que ante la utilización de la COCE natural. Asimismo, se observó una prolongación del tiempo transcurrido hasta la defunción de los roedores que recibieron cocaína. En coincidencia, la administración previa de COCE-L169K/G173Q durante períodos más extendidos se correlacionó con efectos protectores en relación con la letalidad inducida por cocaína.

La sustitución de la administración de solución fisiológica por un tratamiento previo con COCE-L169K/G173Q se asoció con una reducción no significativa de la cantidad de conductas de refuerzo en los animales entrenados para responder a la aplicación de cocaína por un catéter femoral. En función de las determinaciones efectuadas in vivo, la vida media de eliminación de las formas COCE-L169K/G173Q y natural de esta enzima se estimaron en 2.3 horas y 2.2 horas, en orden respectivo (r² = 0.8), pese a las mayores diferencias halladas en los modelos in vitro.

Discusión

Los autores afirman que la COCE-L169K/G173Q se asocia con mayores niveles de estabilidad in vitro y de duración de acción in vivo. Aunque la forma natural de la enzima permite evitar los efectos tóxicos de la cocaína a corto plazo, su inestabilidad a 37 ºC y su breve duración de acción limitan su potencial terapéutico. En cambio, la variante COCE-L169K/G173Q representa una alternativa promisoria para el tratamiento de la adicción a la cocaína debido a la mayor duración de su acción y la posibilidad de inhibir las propiedades de refuerzo de esta sustancia.

Esta mutación presenta una V_MÁX significativamente mayor que la enzima natural, acompañada de un leve incremento de la K_m, atribuido a la porción extendida de la cadena por el reemplazo de lisina en la posición 169. No obstante, la mayor K_m no se asoció con cambios funcionales de la enzima ante la presencia de concentraciones elevadas de cocaína que puede provocar toxicidad in vivo. Además, el aumento de la K_m no redujo la capacidad de la variante COCE-L169K/G173Q para hidrolizar la cocaína con una mayor velocidad que otras mutaciones, como la COCE-T172R/G173Q, incluso ante la disponibilidad de dosis muy bajas de esta sustancia.

Se hace hincapié en que la mutación COCE-L169K/G173Q se correlacionó con un aumento acentuado de la termoestabilidad de esta enzima, que se atribuyó a mecanismos moleculares complejos a nivel de la generación de puentes de hidrógeno y a la intervención de fuerzas de van der Waals. Los estudios efectuados con roedores permitieron confirmar que esta variante de la enzima se asoció con mayor potencia y duración de acción que la relacionada con la forma natural. Se presume que el incremento de la potencia enzimática se debió tanto a la mayor V_MÁX como al aumento de la termoestabilidad, las cuales permitieron una degradación más rápida de la cocaína a altas concentraciones y la posibilidad de mantener la actividad por un período más prolongado. En relación con la autoadministración en los roedores entrenados, los expertos verificaron que el uso de COCE-L169K/G173Q permitía eliminar las propiedades de refuerzo de la cocaína, con permanencia de niveles circulantes de la enzima que resultaban adecuados más allá de las 2 horas posteriores a su administración.

Por otra parte, las discrepancias entre la duración de la vida media de la mutación COCE-L169K/G173Q en los modelos in vivo e in vitro parecen atribuirse a una reducción de los niveles plasmáticos de la enzima, por acción de las proteasas o, de manera menos probable, por filtración glomerular. Los autores admiten que la extensa vida media in vitro constituye un paso promisorio para la creación de una formulación de tratamiento para la adicción a la cocaína.

Conclusiones

La elaboración de la enzima termoestable COCE-L169K/G173Q representa un avance necesario para la terapia de la adicción a la cocaína, aunque su reducida vida media plasmática es un obstáculo que debe superarse. Entre las estrategias para incrementar la vida media in vivo se propone el encapsulado en los glóbulos rojos, la pegilación y la modificación de los residuos glucídicos.

Especialidad: Bibliografía - Clínica Médica