Estudian los Efectos del 5-Fluorouracilo sobre la Apoptosis de los Linfocitos T Jurkat E6

• AUTOR : Aresvik D, Pettersen R, Abrahamsen T, Wright M
• TITULO ORIGINAL : 5-Fluorouracil-Induced Death of Jurkat T-Cells – A Role for Caspases and MCL-1
• CITA : Anticancer Research 30(10):3879-3888, Oct 2010
• MICRO : Los linfocitos T Jurkat E6 son una línea celular que contiene mutaciones en los genes TP53 y BAX, necesarios para poner en marcha el proceso de apoptosis inducido por el 5-fluorouracilo. El presente estudio tiene por objetivo investigar si este fármaco es capaz de producir la apoptosis en dicha línea celular por mecanismos alternativos a los que dependen del TP53 y el BAX.

Introducción

La apoptosis, o muerte celular programada, es de vital importancia para la homeostasis de los tejidos. La alteración de este mecanismo puede contribuir con la génesis del cáncer, así como de enfermedades autoinmunes y degenerativas.

Las cisteínproteasas o caspasas juegan un papel importante en la regulación y ejecución de la muerte celular por apoptosis y pueden activarse por dos mecanismos diferentes, aunque relacionados entre sí: la vía del receptor extrínseco, mediada por los ligandos de los receptores de muerte celular, y la vía intrínseca o mitocondrial, que se inicia por estrés celular.

El estrés celular, por ejemplo, debido al daño del ácido desoxirribonucleico (ADN), produce alteraciones en la función mitocondrial que dan lugar a una cascada de eventos que finaliza con la formación del apoptosoma. La vía mitocondrial está regulada por proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia de las BCL-2. Estas proteínas comparten uno o más dominios BCL-2 homólogos. Las proteínas proapoptóticas multidominio BAX y BAK participan en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa, proceso necesario para que se produzca la apoptosis. Por el contrario, las proteínas antiapoptóticas BCL-2, MCL-1 y BCL-xL inhiben la apoptosis.

La mayoría de los fármacos antineoplásicos tienen como objetivo el ADN. Cuando éste se daña, se activa el factor de transcripción supresor de tumores TP53, el cual se une a secuencias específicas del ADN, de forma tal de activar o reprimir la expresión de un gran número de genes proapoptóticos, tales como BAX, NOXA y PUMA. El fármaco antineoplásico 5-fluorouracilo (5-FU) es un inhibidor de la timidilato sintasa capaz de activar al TP53 por distintos mecanismos. Sin embargo, las células neoplásicas con frecuencia contienen mutaciones de genes clave para la apoptosis, lo que hace a estas células resistentes a la muerte celular.

La línea celular de linfocitos T leucémicos Jurkat E6 presenta mutaciones en los genes TP53 y BAX. La ausencia de función de estos componentes, necesarios para el proceso de muerte celular inducido por 5-FU, sugiere que las células Jurkat podrían ser insensibles a este agente. Los resultados de estudios previos sobre muerte celular inducida por 5-FU en células Jurkat son contradictorios. Por lo tanto, se llevó a cabo un estudio para esclarecer si el 5-FU es capaz de inducir la apoptosis en linfocitos T Jurkat E6 mediante la activación de otras vías alternativas, además de examinar el impacto del agente sobre los distintos mecanismos de muerte celular.

Materiales y métodos

Se utilizó un cultivo de células Jurkat E6, las cuales fueron incubadas con 5-FU (1, 10, 50 o 100 µM). El etopósido y la estaurosporina fueron usados como controles positivos de apoptosis. La muerte celular fue determinada mediante la tinción con Annexin-V-Fluos y yoduro de propidio. Asimismo, se midió la actividad de la caspasa-3 mediante citometría de flujo. El yoduro de 3,3′-dihexiloxacarbocianina fue utilizado para medir los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, mientras que el dihidroetidio fue empleado para examinar la generación de especies reactivas del oxígeno a nivel mitocondrial. Finalmente, se realizó un análisis de inmunotransferencia (Western blot) para investigar la expresión de las proteínas de interés.

Resultados

Investigaciones previas han demostrado que los linfocitos T Jurkat E6 contienen mutaciones en el gen TP53 que dan origen a una proteína defectuosa, así como una mutación en el gen BAX que da como resultado la ausencia total de esta proteína. El análisis de Western blot llevado a cabo en el presente trabajo para verificar la expresión del gen BAX confirmó la ausencia de la proteína en las células Jurkat.

Para investigar si el 5-FU induce la apoptosis en los linfocitos T Jurkat E6, se utilizó la tinción de Annexin-V-Fluos y el yoduro de propidio. Durante la apoptosis, la fosfatidilserina se transloca desde el interior de la membrana plasmática hacia el exterior y se expone en la superficie celular. El Annexin-V tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina, por lo que permite detectar células apoptóticas. Asimismo, la sonda de permeabilidad del yoduro de propidio permite distinguir a las células que presentan integridad de la membrana plasmática de las que no lo hacen. En este estudio, la evaluación por citometría de flujo demostró que la incubación con 5-FU desencadenó la muerte celular en los linfocitos T Jurkat E6 de forma dependiente de la dosis y del tiempo. La respuesta máxima al fármaco se observó a las 72 horas. La proporción de células vivas luego del tratamiento con 100 µM de 5-FU por 72 horas varió entre el 3.6% y el 31.5%. No se obtuvo respuesta con 1 µM de la sustancia examinada.

También, las caspasas son mediadores fundamentales en el proceso de apoptosis. Para determinar si estas proteasas están involucradas en la muerte celular inducida por 5-FU, se examinó el efecto de un inhibidor de las caspasas (el Z-VAD-FMK) sobre la respuesta apoptótica. Por citometría de flujo no se observó una inhibición significativa de la muerte celular con el uso del Z-VAD-FMK en las células tratadas con 5-FU.

Además, se investigó la activación de la caspasa-3, que es un marcador de las células en proceso de apoptosis. Los resultados demostraron que el 5-FU activó a la caspasa-3 de forma dependiente del tiempo y de la dosis, pero lo hizo mucho más lentamente que la estaurosporina. La respuesta fue detectada a las 48 horas de incubación con 50 µM de 5-FU, pero la respuesta máxima fue observada luego de la incubación con 100 µM de 5-FU por 72 horas.

Para demostrar la consecuencia funcional de la caspasa-3 activada, se analizó el clivaje proteolítico de la poli-ADP-ribosa-polimerasa, enzima nuclear involucrada en la reparación del ADN. Esta enzima es sustrato de las caspasas durante la apoptosis, y el clivaje específico de la caspasa-3 (de su forma de 116 kDa a dos fragmentos de 89 y 24 kDa) se considera marcador de apoptosis. En el presente estudio, mediante la técnica de Western blot se encontró claramente el fragmento de 89 kDa resultado del clivaje de la enzima ya a partir de las 48 horas y, especialmente, luego de las 72 horas de incubación con 5-FU.

Dado que la permeabilización de la membrana mitocondrial es un evento temprano en la vía intrínseca de la apoptosis, también se analizó el efecto del 5-FU sobre el potencial de membrana mitocondrial. Sin embargo, en este caso no se observó ningún cambio en dicho potencial luego de la incubación de las células Jurkat con la sustancia en estudio.

La producción de especies reactivas de oxígeno puede causar disfunción y muerte celular. Al analizar el efecto del 5-FU sobre la producción de estos compuestos, solo se observó un leve incremento luego de 48 horas de incubación con 50 y 100 µM de 5-FU.

Finalmente, la proteína MCL-1 pertenece a la familia de las BCL-1 y fue originalmente descripta como proteína antiapoptótica. Sin embargo, esta proteína presenta un proceso transcripcional complejo que modifica su expresión y funcionamiento. Para investigar si la muerte celular inducida por 5-FU en linfocitos Jurkat está mediada por MCL-1, las células fueron tratadas con 50 µM de 5-FU por 24 a 72 horas. Como resultado, la expresión de MCL-1 se redujo significativamente. Esta disminución se asoció con la aparición de una forma más corta de esta misma proteína.

Discusión

En el presente estudio se demostró el efecto del 5-FU sobre las células Jurkat mediante tinción con Annexin y yoduro de propidio, activación de la caspasa-3 y clivaje de la poli-ADP-ribosa-polimerasa. Con el uso de Annexin y yoduro de propidio, se comprobó que las células sufren apoptosis y mueren de manera dependiente del tiempo y de la dosis. Los experimentos con el inhibidor de la caspasa Z-VAD-FMK demostraron que la muerte celular no fue bloqueada significativamente, por lo que se sugiere que la inhibición de la cascada de las caspasas no siempre evita la muerte celular. De todos modos, la participación de las caspasas quedó demostrada por la activación de la caspasa-3. En consecuencia, se sugiere que el 5-FU puede activar las caspasas en las células Jurkat, pero que la muerte celular también podría suceder de forma independiente a dicha activación.

A diferencia de lo encontrado en informes previos, no se observaron cambios en el potencial de membrana mitocondrial luego del tratamiento con 5-FU. En cuanto a la generación de especies reactivas de oxígeno, se presentó un leve incremento en su producción luego de la exposición al agente.

Igualmente, se encontró una forma más corta de MCL-1 luego del tratamiento con 5-FU en los linfocitos Jurkat. Con los controles positivos (etopósido y estaurosporina) se observó el mismo efecto, aunque luego de un tiempo menor. Se sabe que la MCL-1 tiene dos isoformas, una larga antiapoptótica y una corta proapoptótica. La supervivencia de una célula dependería, aparentemente, de un delicado equilibrio entre ambas isoformas. Tanto la isoforma corta como el producto del clivaje de la caspasa-3 parecen tener propiedades proapoptóticas. Por lo tanto, la presencia de una forma de MCL-1 más corta durante el tratamiento de las células Jurkat con 5-FU, probablemente, se asocie con una menor resistencia temprana al fármaco, un mayor estímulo para la muerte celular y una disminución en el número de proteínas MCL-1 de longitud completa.

Conclusión

Los autores concluyen que el 5-FU puede inducir la muerte celular en linfocitos T Jurkat E6 independientemente de la presencia de TP53 y BAX, aunque con participación de las caspasas y de la MCL-1. Aún se requieren más estudios para identificar con mayor precisión el mecanismo de inducción de la apoptosis del 5-FU, así como para determinar en detalle la función de la MCL-1 en este proceso. Finalmente, mencionan que podría ser interesante estudiar la relación entre MCL-1 y otras proteínas de la familia BCL-1, especialmente la BAK.

 

Especialidad: Bibliografía - Oncología