El avance de la Proteómica Química Provee un Nuevo Potencial para el Descubrimiento de Nuevas Clases de Drogas

• AUTOR: Han SY, Kim SH
• TITULO ORIGINAL: Introduction to Chemical Proteomics for Drug Discovery and Development
• CITA: Archiv der Pharmazie 340(4):169-177, Abr 2007

Introducción

La proteómica química tiene el objetivo de identificar y validar, de modo rápido y sistemático, a proteínas blanco ligadas directamente con moléculas bioactivas a través del diseño, la síntesis y aplicación de pruebas químicas relevantes. Se propone como una ciencia multidisciplinaria para la integración de especialidades como la química, bioquímica, biología, biología estructural, proteómica e informática. La estrategia integrada de la proteómica química aporta información sobre el sitio de ligadura de moléculas pequeñas bioactivas en las proteínas blanco y constituye el punto de partida para la selección de drogas a partir de la estructura de esta última.

Asimismo, el descubrimiento de las vías de señales de transducción que contribuyen al estado de la enfermedad ha sido la primera fase para el proceso de elaboración de nuevas drogas. El conocimiento de estas señales y el mapeo de las moléculas que intervienen en ellas contribuyeron al control de la proliferación aberrante de las células, órganos y el cuerpo en el estado de enfermedad. De esta manera, el esfuerzo para revelar las vías de las señales y las moléculas comprometidas en determinados estados de enfermedad aún constituye el mecanismo para el descubrimiento de nuevas drogas. Sin embargo, esto no es suficiente, dado que la comunicación entre las señales y la enfermedad es compleja, lo que dificulta el desciframiento de la base fisiopatológica de las señales específicas de la enfermedad.

La información sobre las proteínas blanco a partir de la función y afinidad ha sido empleada en años recientes para seleccionar y evaluar nuevos compuestos. En la estrategia basada en la función, se miden los efectos de los compuestos sobre la actividad biológica de la molécula blanco; en tanto que según la afinidad, los compuestos se seleccionan por la tendencia a ligarse con la proteína blanco. Por lo tanto, evaluar la relación entre el elemento ligador (sustrato enzimático, molécula pequeña bioactiva) y la proteína blanco es importante para el descubrimiento de nuevas drogas. La proteómica química y la genómica han originado mucho interés para su aplicación en el estadio temprano del descubrimiento de drogas.

Impacto de la proteómica química

El uso de proteínas blanco validadas (identificadas y evaluadas por proteómica química) solucionaría el problema de la no ligadura de las pequeñas moléculas bioactivas con las proteínas blanco. El estudio de la proteómica química sobre las proteínas blanco de moléculas pequeñas bioactivas puede revelar modos celulares alternativos de acción de estas moléculas que no fueron reconocidos como terapéuticos. Por ejemplo, las pirido-2,3-d-pirimidinas fueron inicialmente elaboradas como agentes antiproliferativos contra las proteínas blanco quinasa tirosina comprometidas en el cáncer, pero se observó que esta ligadura no se establecía; paralelamente, se determinó que tenía un efecto inhibitorio potente sobre las quinasas serina/treonina (p38-alfa y RIPK2).

En síntesis, el desciframiento de la interacción específica entre las moléculas pequeñas bioactivas con sus proteínas blanco por la estrategia integrada de la proteómica química contribuye al conocimiento del proceso de las moléculas pequeñas bioactivas en las células y el cuerpo y, consecuentemente, a la elaboración de nuevos fármacos.

Proteínas blanco y sitios de ligadura

La función biológica de la mayoría de las proteínas depende de la ligadura directa y específica de sus elementos ligadores con las áreas espaciales llamadas sitios de ligaduras. El sitio de ligadura (pocket) puede definirse como la región de una proteína que frecuentemente consiste en una cavidad en la superficie de ésta compuesta por un orden particular de aminoácidos. La ligadura depende de la formación de contactos entre los grupos químicos del ligador y aquellos en el sitio de ligadura de la proteína blanco. La cavidad en la estructura proteica determina el reconocimiento de la proteína blanco; de este modo, las características de un sitio de ligadura pueden proveer el enlace perdido necesario para establecer la correlación entre el espacio químico y el genómico.

Tecnologías para la purificación y el enriquecimiento de las proteínas/péptidos blanco

Para purificar, enriquecer e identificar las proteínas/péptidos blanco que pueden interactuar directamente con las moléculas pequeñas bioactivas se usan diversos mecanismos. Entre éstos, nanopartículas, la prueba de fotoafinidad, la prueba basada en la actividad (PBA) y la matriz de afinidad química.

Nanopartículas

Hay diversas formas de nanopartículas en la separación biológica. Las más difundidas son las nanopartículas doradas (NPD) conjugadas biomolecularmente. Las NPD encapsuladas con carbohidratos, de introducción reciente, permiten un rápido mapeo de la secuencia del péptido en la proteína blanco mediante el reconocimiento de los hidratos de carbono.

Prueba de fotoafinidad

La técnica de fotoafinidad es particularmente útil para esclarecer la estructura proteica en la interfase de la molécula pequeña bioactiva a través de sitios interactivos marcados fotoquímicamente. El diseño de la prueba química es paralelo a la relación estructura-actividad. Generalmente la introducción de una molécula fotorreactiva dentro de la estructura de una molécula pequeña bioactiva causa disminución de la actividad biológica, pero aun así las pruebas con una disminución de la actividad de 1 000 veces son útiles para la investigación de la interacción ligador-proteína.

La región de unión entre biotina, molécula fotorreactiva y la molécula pequeña bioactiva sirve para propósitos múltiples: provee suficiente espacio para prevenir la disminución de la interacción entre el ligador y el sitio activo de la proteína blanco y prueba los requerimientos estructurales para la actividad biológica óptima.

Las moléculas fotorreactivas, como azida, diazirina y benzofenona, se usaron como precursores para intermediarios altamente reactivos generados por fotólisis. El perfluorofenil azida es el fotomarcador más usado.

PBA

La proteómica química basada en la actividad se usa para el perfil del estado funcional de enzimas en el complejo proteoma. La PBA consiste en 3 elementos básicos: un grupo electrofílico reactivo (GR); la biotina o fluorofore, útiles para la purificación subsecuente o visualización de enzimas premarcadas; y un enlazador que conecta estos 2 elementos y que provee interacción selectiva en la ligadura y previene la congestión estérica. La PBA fue usada para más de una docena de clases enzimáticas que incluyeron proteasas, quinasas, fosfatasas, glicosidasas y oxidorreductasas.

Matriz de afinidad química

Las moléculas pequeñas bioactivas tienen un grupo funcional como un amino expuesto al solvente, carboxilo o hidroxilo, que pueden acoplarse a una resina cromatográfica. Estas resinas producen la inmovilización de las moléculas bioactivas a los grupos funcionales terminales de moléculas hidrofílicas. Luego de verificar la retención de la actividad biológica, el acoplamiento de resina de afinidad química conjugada-pequeña molécula se utiliza para la purificación de las proteínas blanco desde los extractos biológicos relevanes. Se utilizan 2 matrices de afinidad química (positiva y negativa) simultáneamente. Por estas matrices de afinidad, se identificaron diversas proteínas, como la proteína ligada a FK506 y la deacetilasa histona 1.

Integración de cromatografía líquida y análisis de espectrometría de masa

Esta combinación tuvo un impacto significativo sobre el desarrollo de drogas en la década pasada. En general, las proteínas que son enriquecidas por el uso de mecanismos químicos, como las pruebas o matrices de afinidad, pueden ser separadas por gel y analizadas subsecuentemente por instrumentos de espectrometría de masa (EM). Sin embargo, la sensibilidad limitada de los métodos tradicionales de separación no ofrece información sobre las fracciones de moléculas de bajo peso molecular. Para evitar este problema, las proteínas blanco enriquecidas pueden ser tratadas con tripsina y la mezcla resultante estar sujeta a la fase de análisis por cromatografía líquida-EM/EM. La implementación exitosa de la proteómica química depende no sólo de la eficiencia de los procedimientos de purificación sino de la sensibilidad del análisis de EM.

Validación de la proteína blanco por la tecnología de resonancia por plasmón de superficie

Las técnicas tradicionalmente usadas para verificar la especificidad de las proteínas blanco, como el análisis de western blot, no proveen resultados cuantitativos de las sensibilidades para el enlace de la molécula pequeña bioactiva con la proteína blanco. Las propiedades fisicoquímicas para las moléculas ligadas a su proteína blanco afectan la función biológica de esta última. La imagen de la resonancia por plasmón de superficie (RPS) permite evaluar las interacciones biomoleculares por la detección del cambio de intensidad de la luz reflejada que resulta de los cambios en el índice refractario sobre la superficie dorada. Las modificaciones en la concentración de la masa en la superficie pueden ser detectados en tiempo real con los datos presentados como un sensorgrama (respuesta de la RPS en relación al tiempo) que indica la asociación y disociación de los complejos con la cinética.

Aplicaciones de la proteómica química

Los métodos de pruebas químicas pueden originar una nueva manera para identificar nuevas proteínas blanco (descubrimiento del blanco) e identificar y evaluar los inhibidores químicos (descubrimiento del inhibidor). La identificación de los sitios de ligadura de una proteína blanco con la molécula pequeña bioactiva otorga nuevas estrategias en el proceso de descubrimiento y desarrollo de drogas. El uso de la RPS para evaluar directamente la ligadura identifica con rapidez los compuestos con especificidad para ligarse en el sitio de una proteína blanco o los que podrían ligarse. Por ejemplo, los datos cinéticos obtenidos de los biosensores por RPS se usaron en la selección de inhibidores de la quinasa; luego de esta selección, se continúa con el hallazgo y la optimización de los compuestos.

La PBA por sí misma mostró tener gran potencial para facilitar los procesos de identificación de drogas. Junto con la selección secundaria, la tecnología por RPS puede aplicarse en una variedad de campos que incluyen la caracterización de la actividad, el estudio de la especificidad del compuesto, la evaluación in vitro temprana del ADMET (adsorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) y el análisis cuantitativo.

Se ha investigado por biosensores RPS la presencia de patógenos, toxinas, drogas veterinarias y aditivos nutricionales. Los métodos de selección virtual aumentaron como un medio complementario para el hallazgo de moléculas pequeñas que son activas con un blanco particular.

Conclusión

El éxito del descubrimiento de nuevas moléculas terapéuticas se decide en el momento de elegir el blanco adecuado, dado que una mala elección significa pérdida de tiempo y dinero. La proteómica química presenta la posibilidad de identificar rápidamente el blanco y conseguir una calidad más alta para el diseño, la síntesis y aplicación de pruebas químicas relevantes.

En este artículo, la relación entre la química y la biología dirige la identificación y selección del blanco mediante una estrategia integrada. La química provee las tecnologías para el diseño y la síntesis de los instrumentos químicos; luego, la biología, bioquímica, proteómica, biología estructural, bioinformática y la fisicoquímica contribuyen a la selectividad de los compuestos y su interacción con las proteínas blanco. La detección de los sitios de ligaduras relevantes en una proteína blanco para una molécula pequeña bioactiva ofrece una nueva aplicación estratégica para el hallazgo, la optimización y el desarrollo de un sistema de selección de drogas basado en la estructura.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología