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Analizan el Posible Papel del Dienogest, en la Diferenciación y la Proliferación de las Células del Estroma Endometrial
- AUTOR:Okada H, Nakajima T, Kanzaki H y colaboradores
- TITULO ORIGINAL:The Inhibitory Effect of Dienogest, a Synthetic Steroid, on the Growth of Human Endometrial Stromal Cells in Vitro
- CITA:Molecular Human Reproduction 7(4):341-347, Abr 2001
- MICRO: Las células endometriales cultivadas en presencia de dienogest presentaron cambios morfológicos y produjeron prolactina. Los resultados de experimentos in vitro muestran un efecto inhibidor directo del dienogest sobre la proliferación de estas células.
Introducción
La endometriosis tiene una sintomatología variada que incluye dolor pelviano, dismenorrea, dispareunia e infertilidad, lo que la vuelve un trastorno ginecológico complejo. Entre las drogas más comúnmente utilizadas se encuentran el danazol, los agonistas de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) y las progestinas. Si bien estos agentes son relativamente eficaces contra la endometriosis, causan numerosas reacciones adversas, por lo que la elaboración de nuevos agentes más eficaces y con menor cantidad de efectos secundarios debe tener en cuenta dichas características.
El dienogest, un esteroide sintético que combina las propiedades de los derivados tanto de la nortestosterona 19 como de la progesterona, tiene propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas particulares. Inicialmente, el dienogest fue evaluado por su valor como anticonceptivo. Sin embargo, algunos estudios recientes mostraron que este compuesto redujo la cantidad de implantes de tejido endometrial, lo que sugiere sus posibles efectos sobre la endometriosis. Por otra parte, el dienogest fue muy eficaz en la mejoría de las lesiones y en el alivio de los síntomas de la endometriosis.
Si bien actualmente, este fármaco está siendo investigado como un agente para el tratamiento de la endometriosis, los efectos que causa sobre el endometrio humano no han sido aún establecidos completamente.
La decidualización es el proceso de diferenciación del endometrio durante la fase secretora del ciclo menstrual y durante el embarazo. En forma reciente, se ha desarrollado un modelo in vitro del proceso mencionado, en el cual las células humanas del estroma endometrial (CEE) cultivadas bajo la presencia de progesterona, sufren cambios morfológicos y producen proteínas deciduales como la prolactina y la proteína transportadora del factor de crecimiento similar a la insulina1 (IGFBP-1) (Irwin y col, 1991; Tabanelli y col., 1992).
En este estudio, se investigaron los efectos directos del dienogest sobre la proliferación y la diferenciación de CEE cultivadas in vitro.
Materiales y métodos
Aislamiento y cultivo de las CEE
Las muestras de tejido fueron lavadas en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/Ham’s F-12, cortadas en trozos < 1 mm3 e incubadas durante 2 horas a 37°C en DMEM/F-12 con 1 mg/ml de colagenasa y 0.005% de desoxirribonucleasa tipo I. La suspensión celular fue diluida con 2 volúmenes de DMEM/F-12 y se colocó en un tubo de centrifugación. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo para recolectar las células individuales en suspensión y fue lavado tres veces para utilizarse como la fuente de CEE. Dos millones de CEE viables se cultivaron en frascos de 75 cm2 con DMEM/F-12 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (STF), 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina a 37°C en un ambiente humidificado con CO2 al 5%, para luego ser colocadas en placas y reducir la contaminación de las células epiteliales. Las CEE luego fueron transferidas a placas de pocillos para las pruebas de inmunohistoquímica.
Tratamiento con hormona esteroide
Se mezclaron 100 ml de STF con 0.25 g de carbón activado y con 0.025 g de dextrano para eliminar el efecto de las hormonas esteroides endógenas. Se agitó y centrifugó a 56°C durante 30 minutos para separar el dextrano revestido con carbón que había precipitado. El sobrenadante fue sometido al mismo tratamiento a 37°C y el dextrano despojado de STF (DCS) se filtró para ser almacenado a -20°C.
Luego de uno a 2 pasajes las CEE confluyeron y fueron sometidas al método Northern blot y a radioinmunoensayo. Estas CEE se cultivaron y se reemplazó el medio de cultivo por rojo fenol libre de DMEM/F-12, enriquecido con 10% de DCS-STF. Después de 48 horas, se agregaron progesterona, estrógenos (estradiol 17 beta), danazol, dienogest, RU-486 o DMSO como vehículo de control. Los medios de cultivo se cambiaron cada 3 días.
Ensayo de proliferación celular
Se midió la proliferación de las CEE por medio de un ensayo basado en la incorporación de [metil-3H]timidina. Las células fueron cultivadas entre 2 y 4 días y la cantidad resultante (5×104 células) se transformaron en células quiescentes al ser incubadas en presencia de rojo fenol libre de DMEM/F-12, enriquecido con 0.1% de DCS-STF. Después de 48 horas en ausencia de suero, el medio fue reemplazado por un medio de control de rojo fenol libre de DMEM/F-12 enriquecido con 1% DCS-STF, que contenía el vehículo de control o los esteroides. Luego de 20 horas de incubación se añadió la [metil-3H]timidina y las CEE fueron sometidas a diversos lavados con solución buffer y con ácido tricloroacético. Los estudios se realizaron con 5 cultivos obtenidos a partir de 5 pacientes.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± la desviación estándar (DS). Las diferencias en los parámetros medidos en los distintos grupos fueron evaluadas estadísticamente mediante el análisis de la varianza con mediciones repetidas. Un nivel de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Tanto la morfología como la producción de prolactina permiten determinar la decidualización de las CEE. Estas células cultivadas con estradiol, mantuvieron su apariencia fibroblástica durante todo el período de cultivo. En contraposición, en presencia de 10-8 mol/l de estradiol y de 10-6 mol/l de dienogest, las CEE se transformaron en células poligonales grandes, similares a las células deciduales in vivo. Los autores evaluaron si el estradiol más el dienogest regularían la expresión del ARN mensajero (ARNm) de la prolactina, mediante la utilización de las células cultivadas.
El nivel de ARNm de la prolactina resultó indetectable en las muestras obtenidas de las CEE, después de 12 días de cultivo con estradiol. En cambio, la presencia de 10-8 mol/l de estradiol más 10-6 mol/l de progesterona o de10-8 mol/l de estradiol más 10-6 mol/l de dienogest, provocó un aumento similar y significativo en los niveles de ARNm de la prolactina. Las concentraciones de esta hormona en el medio de cultivo, medidas por radioinmunoensayo, también mostraron los mismos resultados que los experimentos del ARNm. El tratamiento de las CEE con 10-9 a 10-6 mol/l de dienogest provocó el aumento de los niveles de ARNm de la prolactina así como el incremento de la síntesis de dicha hormona, según la dosis administrada.
Además, el antiprogestágeno RU-486, con afinidad por los receptores de progesterona, inhibió casi por completo la producción de prolactina inducida por dienogest.
También observaron los autores que la proliferación celular se inhibía cuando la concentración de dienogest, era mayor de 10-7 mol/l.
El agregado de 10-7 mol/l de danazol no suprimió la incorporación de [3 H]timidina por parte de las CEE, mientras que concentraciones mayores (10-5 mol/l) de danazol inhibieron la proliferación. Concentraciones de progesterona mayores de 10-7 mol/l también suprimieron el crecimiento de las CEE, de acuerdo a la dosis administrada.
Discusión
En este estudio, los autores evaluaron el posible efecto del dienogest sobre la diferenciación y la proliferación in vitro de las CEE. A su vez, este modelo permitió investigar la producción y la regulación de prolactina, cuya síntesis por parte de las CEE es inducida por progesterona o por dienogest. La afinidad del dienogest por los receptores de progesterona, tanto de seres humanos como de rata y de conejo, fue menor del 10%, del 11% y del 17%, respectivamente, comparada con la afinidad de la progesterona (Kaufmann y col., 1983;Oettel y col., 1993; Kuhl, 1996; Katsuki y col., 1997). Sin embargo, los autores de la investigación actual encontraron que las CEE cultivadas en presencia de dienogest tienen cambios morfológicos y producen prolactina. En este sentido, el dienogest actuó de manera similar a la progesterona. Por otra parte, el RU-486 inhibió casi por completo la producción de prolactina inducida por dienogest. Estos resultados indican que el efecto del dienogest podría producirse a través del receptor de progesterona de las CEE. A su vez, los efectos del dienogest sobre el endometrio podrían ser distintos a los efectos sobre los tejidos endometriósicos, debido a la expresión diferente de los receptores de esteroides en ambas estructuras (Fujimoto y col., 1999; Misao y col., 1999). Sin embargo, los expertos manifiestan que la utilización de células endometriales ectópicas sería útil en la comprensión del mecanismo del efecto de dienogest en el tratamiento de la endometriosis.
Estudios anteriores demostraron que las CEE expresan receptores nucleares de hormonas esteroides, como la progesterona, los andrógenos y los estrógenos. El modelo presentado en esta investigación permitió analizar los efectos mitogénicos de este tipo de hormonas. El agregado de dienogest al medio de cultivo inhibe el desarrollo de las CEE de acuerdo con la dosis administrada, de manera similar a la inhibición causada por la progesterona.
Los autores determinaron que el dienogest suprime de forma directa la proliferación de las CEE, si bien se desconoce aún el mecanismo exacto por el cual se produce esta inhibición.
Destacan los expertos el hecho de que la acción antiproliferativa del dienogest es revertida parcialmente por el RU-486. Este hallazgo sugiere que el efecto inhibitorio del dienogest en la proliferación de las CEE depende tanto de su acción progestacional como de otras.
Conclusión
Las CEE cultivadas en presencia de dienogest tuvieron cambios morfológicos y produjeron prolactina. Los resultados de los experimentos in vitro muestran un efecto inhibidor directo del dienogest sobre la proliferación de las CEE. Por lo tanto, los autores sugieren que este compuesto sería un agente potente para el tratamiento de la endometriosis, debido a su efecto inhibitorio de la proliferación in vivo de los tejidos endometriósicos ectópicos.
Especialidad: Bibliografía - Ginecología