Aporte de la Biología Molecular al Diagnóstico de las Infecciones Bacterianas Sistémicas

• AUTOR : Fenollar F, Raoult D
• TITULO ORIGINAL : Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections Caused by Non-Cultivable Bacteria
• CITA : International Journal of Antimicrobial Agents 30(1):7-15, Nov 2007
• MICRO : El diagnóstico molecular es una herramienta útil para el diagnóstico de enfermedades sistémicas cuando los métodos convencionales de cultivo tienen un rédito bajo.

Introducción

Las infecciones sistémicas se asocian con cifras elevadas de morbimortalidad. Los hemocultivos son el método diagnóstico más importante en estos casos y, en condiciones ideales, la muestra debe extraerse antes del inicio del tratamiento antibiótico empírico. Sin embargo, es un método lento y de baja sensibilidad, tanto en aquellos pacientes que hayan recibido previamente antimicrobianos como en los enfermos infectados por microorganismos intracelulares o por cepas de cultivo dificultoso, como las asociadas con las endocarditis con hemocultivos negativos.

La administración precoz de antibióticos se relaciona con el pronóstico de estos pacientes, en especial en aquellas situaciones en las que se sospecha una infección por gérmenes de crecimiento lento. En los casos en los que los enfermos no mejoran o incluso empeoran, puede ser necesario un cambio empírico en el tratamiento hasta tener los resultados. En consecuencia, la caracterización precoz del agente etiológico de estas infecciones permite adaptar el esquema terapéutico y, por lo tanto, reducir las tasas de morbimortalidad.

Por otra parte, los ataques terroristas recientes han causado un nivel de alarma mayor por el uso potencial de agentes biológicos. La mayoría de las bacterias utilizadas con este fin son de difícil desarrollo y requieren para su identificación de laboratorios con un nivel alto de tecnología y bioseguridad.

La detección de los microorganismos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una opción promisoria. De todos modos, la interpretación adecuada de los resultados puede ser difícil.

Conceptos generales

La PCR puede efectuarse tanto en muestras de suero como en biopsias vasculares o de las válvulas cardíacas. Cuando no hay una sospecha clínica definida, se prefiere el uso de técnicas de amplio espectro dirigidas a genes presentes en casi todas las bacterias, como los del ARN ribosomal de las subunidades 16S o 23S. Sin embargo, en estos casos las técnicas de amplificación deben estar acompañadas sistemáticamente por secuenciación o por hibridización. De todos modos, el número creciente de genomas bacterianos que se encuentran codificados permite la repetición de secuencias para el diagnóstico.

Un avance importante en esta área es la PCR cuantitativa en tiempo real, que elimina la necesidad de la amplificación mediante el intercalado de ADN fluorescente, así como de sondas moleculares dirigidas a la secuencia elegida. Esta nueva técnica es más rápida y reproducible que la convencional y tiene menos riesgo de contaminación. En cuanto a la PCR con cebadores internos, los autores no recomiendan su uso excepto en condiciones específicas.

En relación con las técnicas de PCR de amplia gama, cada amplicón positivo se secuencia de manera sistemática para evitar los errores de interpretación que se producen en caso de contaminación. Así, los autores admiten que, en líneas generales, la detección de una nueva secuencia en un laboratorio en particular corresponde a un resultado positivo verdadero. De todos modos, cuando ese resultado tiene un valor predictivo bajo, se recomienda repetir el procedimiento para un segundo gen.

Las fuentes probables de contaminación en las pruebas de PCR incluyen la de la toma de la muestra, la del medio de transporte, la del aislamiento del ADN y la del propio laboratorio.

Algunos microorganismos específicos

El género Rickettsia incluye a distintas bacterias intracelulares capaces de provocar, entre otros, la fiebre exantemática y el tifus epidémico. Sin embargo, debido a que las manifestaciones clínicas son inespecíficas, las pruebas de laboratorio resultan fundamentales para la identificación de la enfermedad. De todas maneras, la serología puede ser negativa en la primera fase de la evolución y, además, se ha demostrado reacción cruzada entre los reactivos para las diferentes especies.

Los autores afirman que, si bien las distintas técnicas de PCR son útiles para el diagnóstico de las afecciones producidas por las rickettsias, se destaca la PCR cuantitativa en tiempo real. Este examen se realiza tanto sobre tejidos del hospedero (sangre, puerta de entrada) como sobre los vectores (artrópodos). En el caso de las muestras séricas, el material debe conservarse a temperatura ambiente para trabajar sobre los leucocitos sedimentados.

En cuanto a la llamada «PCR suicida», que consiste en una prueba con cebadores internos dirigidos a un gen nunca amplificado con anterioridad en el laboratorio, permite evitar la contaminación con amplicones utilizados en exámenes previos.

La fiebre Q, por otro lado, es una zoonosis de amplia distribución mundial que puede presentarse de manera aguda o crónica y se ha asociado con neumonía, con hepatitis e incluso con endocarditis con hemocultivos negativos. La principal herramienta para el diagnóstico molecular es la serología, aunque no se encuentra disponible con facilidad. Las técnicas de PCR con cebadores internos permiten la detección de la enfermedad dentro de las 2 primeras semanas de evolución. Pese a que se ha codificado todo el genoma de Coxiella burnetii, causante de la fiebre Q, se prefiere como elemento de repetición al gen IS 11-11 en los pacientes con la enfermedad activa, debido a su sensibilidad y especificidad elevadas.

En cuanto a la bartonelosis, se manifiesta a través de distintos síndromes, entre los que se incluyen la angiomatosis bacilar, la fiebre de las trincheras y la endocarditis. La PCR permite reducir el tiempo hasta el diagnóstico de la infección por medio de las técnicas que amplifican la expresión de distintos genes, entre los cuales se destacan el PAP31 y la cadena alfa de la ribosintetasa.

Los investigadores hacen especial mención a la enfermedad de Whipple, que puede presentarse de manera polimórfica y poco específica. Si bien se la ha considerado una afección principalmente digestiva, muchos pacientes presentan lesiones histológicas compatibles con esta enfermedad, pero sin manifestaciones gastrointestinales. Así, esta infección puede dar lugar, entre otras formas clínicas, a endocarditis con hemocultivos negativos. Por otro lado, la tinción con ácido periódico de Schiff tiene baja especificidad y sólo es aplicable en las biopsias. De acuerdo con los autores, la PCR dirigida al gen que codifica la subunidad 16S del ARN ribosomal de Tropheryma whipplei es aplicable en distintos tejidos y fluidos biológicos. De todos modos, los investigadores recuerdan que los resultados deben interpretarse con cautela, debido a que las técnicas con cebadores internos tienen una frecuencia alta de falsos positivos, probablemente como consecuencia de contaminación.

Endocarditis infecciosa

El diagnóstico de la endocarditis infecciosa se realiza principalmente por el hallazgo de vegetaciones en el ecocardiograma en un paciente con hemocultivos positivos. Sin embargo, en numerosas oportunidades estos métodos no permiten llegar al diagnóstico, motivo por el cual se han creado algunos sistemas de puntuación como el de Duke, que se basan en criterios clínicos y en estudios complementarios.

Los hemocultivos seriados, con al menos 3 tomas de 40 ml, son esenciales para realizar el diagnóstico. En algunos casos, se requiere de técnicas especializadas para la identificación de ciertos microorganismos como C. burnetii, Bartonella spp, T. whipplei y Brucella spp. La proporción de endocarditis con hemocultivos negativos es variable, pero de modo esquemático se considera que la mitad de los casos corresponde a pacientes que han recibido antibióticos con anterioridad, mientras que en los restantes se debe a la infección por bacterias intracelulares o por microorganismos de difícil desarrollo en los medios de cultivo. En este grupo, los autores proponen inicialmente el estudio serológico para la detección de C. burnetii y de Bartonella spp. Si estos resultados son negativos o no pueden efectuarse, se recomienda la implementación de técnicas de diagnóstico molecular.

Así, los expertos sugieren el uso de PCR de amplia gama, basada en la amplificación del ARN ribosomal de la subunidad 16S, especialmente en resecciones de tejido valvular. Esta técnica permite identificar tanto la infección por estreptococos en los pacientes tratados en forma previa con antibióticos, como las enfermedades causadas por gérmenes de difícil desarrollo, entre los que se incluyen Granulicatella spp, Abiotrophia spp, Bartonella spp, C. burnetii, T. whipplei, Mycoplasma hominis y Mycobacterium spp.

Además, el ADN de los agentes causales puede persistir meses o incluso años después de la resolución clínica de la afección, por lo cual la relación entre una endocarditis en curso y los resultados deben ser interpretados cuidadosamente. Por otro lado, los investigadores aseveran que, de acuerdo con su experiencia, la detección por técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos bacterianos en las válvulas cardíacas puede considerarse un criterio en la puntuación de Duke, al considerarlo un equivalente de la presencia de un germen.

Bioterrorismo

Los Centers for Disease Control and Prevention de los EE.UU. han dividido a las bacterias que pueden ser utilizadas potencialmente en ataques terroristas, en 2 grupos: categoría A (Bacillus anthracis, Francisella tularensis y Yersinia pestis) y categoría B (Brucella spp, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psitacii, C. burnetii, Rickettsia prowazekii y R. rickettsii). La mayoría de estos microorganismos requiere técnicas especiales para su cultivo, así como importantes normas de bioseguridad. El diagnóstico molecular es una alternativa para el diagnóstico rápido, si bien la circulación limitada de estos gérmenes impide la obtención sencilla de controles positivos.

Conclusiones

Los autores afirman que la PCR representa un avance en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. La tecnología disponible permite conocer el genoma de las bacterias en muchos casos. La limitación principal de las técnicas moleculares es que no es posible conocer en forma simultánea la sensibilidad antibiótica de los gérmenes identificados. Por otra parte, los expertos recomiendan cautela en la interpretación de los resultados, así como la aplicación de procedimientos técnicos y de control de manera rigurosa.

Especialidad: Bibliografía - Infectología