Laboratorios Bagó > Bibliografías > Un Oligonucleótido Antisentido de la Apolipoproteína B Disminuye el Colesterol de la Lipoproteína de Baja Densidad en Ratones Hiperlipémicos sin Causar Esteatosis Hepática

La apolipoproteína B (apoB) es la principal apolipoproteína de las lipoproteínas de baja densidad (LDL [low-density lipoprotein]) y de su precursor metabólico, las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL [very-low-density lipoprotein]). En el intestino, la apoB participa del ensamblado de los quilomicrones y en la captación de los ácidos grasos de la dieta. El gen humano de la apoB aporta 2 proteínas: la apoB-100 y la apoB-48. La elevación de los niveles de la apoB y del colesterol asociado a LDL (LDLc) se relaciona con aterosclerosis, hipercolesterolemia familiar, deficiencia familiar de la apoB-100 e hipercolesterolemia familiar combinada. Por su parte, las alteraciones del metabolismo de la apoB-100 se asocian con un incremento del riesgo de enfermedad coronaria, en especial en individuos con diabetes u obesidad. Se ha observado que las mutaciones que alteran la síntesis de la apoB y disminuyen sus niveles plasmáticos se vinculan con un riesgo menor para desarrollar aterosclerosis, lo que ha generado interés por desarrollar fármacos que actúen en este nivel.Los oligonucleótidos antisentido (ASO) pertenecen a un nuevo grupo de drogas que reducen de manera segura y con gran efectividad los niveles de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) específicos. Dado que estos fármacos se distribuyen en el hígado, se planteó la necesidad de bloquear la secreción hepática de la apoB, por lo cual se diseñó una molécula antisentido específica para la apoB-100 murina y se evaluó su eficacia en varios modelos de hiperlipidemia.

Resultados

Caracterización in vitro de los oligonucleótidos antisentido de la apoB-100 murina

Se analizaron múltiples ASO quiméricos dirigidos molecularmente a varias regiones del gen de la apoB-100 y se estudió su capacidad para disminuir los niveles del ARNm de dicha proteína en hepatocitos primarios murinos. Se seleccionaron los 2 compuestos más potentes -ISIS 147764 e ISIS 147483- y se observó que ambos redujeron los niveles del ARNm de la apoB-100 en forma dependiente de la dosis.

Reducción in vivo de la apoB-100 y la apoB-48 murina hepática en los ratones C57BL/6 alimentados con una dieta de alto contenido en grasas

El ISIS 147764 fue aplicado a ratones del tipo salvaje (C57BL/6) por vía intraperitoneal 2 veces a la semana durante 6 semanas y los niveles del ARNm de la apoB-100 hepática fueron cuantificados con la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. Estos niveles se redujeron también en forma dependiente de la dosis aplicada.

Los niveles hepáticos y séricos de la apoB-100 y apoB-48 se analizaron con western blotting. Luego de 6 semanas de tratamiento con el ASO-apoB-100 se comprobaron reducciones de los niveles hepáticos de la apoB-100 en comparación con los controles, que recibieron solución fisiológica. Los niveles proteicos fueron casi inexistentes a la máxima dosis recibida (50 mg/kg). Los niveles plasmáticos de la apoB-100 y los hepáticos y séricos de la apoB-48 también fueron suprimidos en forma efectiva.

Efecto del tratamiento con el ASO-ApoB-100- sobre las apoB intestinales en los ratones C57BL/6 con dieta hipergrasa

Luego de 8 semanas de tratamiento con ISI 147764, el ARNm de la apoB-100 intestinal se redujo un 54% en comparación con los animales tratados con solución fisiológica. El grado de supresión del ARNm fue menor que el previamente observado en el hígado de los animales tratados con ASO. Debe destacarse que aunque los niveles de la apoB-100 se redujeron alrededor del 40%, los de la apoB-48 no se diferenciaron en el aspecto estadístico del de los animales tratados con solución fisiológica.

Efecto de la supresión de la apoB-100 sobre los lípidos y las lipoproteínas

El tratamiento con 50 mg/kg de ISIS 147764 disminuyó los niveles del ARNm de la apoB-100 88% y los del colesterol total, 55%. Los niveles del LDLc se redujeron 66% con 25 mg/kg y 88% con 50 mg/kg. El número absoluto de lipoproteínas con contenido de apoB-100 disminuyó en forma significativa, según lo establecido por la espectroscopia. Lo mismo sucedió con los niveles de triglicéridos plasmáticos. Sin embargo, los quilomicrones no disminuyeron.

Comienzo de acción

Para determinar las características cinéticas del ASO, se trató a los ratones con 50 mg/kg de ISIS 147764 2 veces por semana durante 6 semanas. Se analizaron las concentraciones hepáticas de la droga intacta, el ARNm de la apoB-100 hepática y los niveles del LDLc a las 48 horas después de la primera dosis y en las semanas 1, 2, 4 y 6. El ARNm de la apoB-100, el colesterol total y el LDLc fueron suprimidos en forma dependiente del tiempo; los niveles del ARNm y de las proteínas hepáticas se redujeron un 50% en 48 horas después de la primera dosis. El estado estacionario alcanzó su máximo a las 6 semanas. El colesterol total se redujo 64% en la semana 4 y el LDLc, 40% luego de 1 semana. Las reducciones en ARNm, proteínas, colesterol total y LDLc fueron máximas en las 4 a 6 semanas de tratamiento.

Duración del efecto

Todos los parámetros experimentales regresaron en forma paulatina a sus niveles previos tras la interrupción de la administración del ASO; sin embargo, los efectos del ISIS 147764 fueron prolongados. Seis semanas luego del cese del tratamiento, las concentraciones hepáticas del fármaco se redujeron de 335 µcg/g a 70 µcg/g. Los niveles hepáticos del ARNm de la apoB-100 se redujeron 37% (comparados con el 84% del inicio); el colesterol total, 38% y el LDLc, 36%. Los efectos farmacológicos fueron insignificantes a las 8 semanas y se correlacionaron con la disminución de los niveles hepáticos del ASO.

Comparación del ISIS 147764 en modelos múltiples de hiperlipidemia murina

La expresión del ARNm de la apoB-100 hepática se redujo 73% a 87% en todos los ratones tratados, pero la inhibición fue mayor en aquellos que recibieron dietas con alto contenido graso. Los ratones deficientes en apolipoproteína E (Apoe), que presentaron los niveles más altos de apoB-48 y los más bajos de apoB-100, resultaron los menos sensibles a los efectos hipolipemiantes (25% de reducción del colesterol total, 40% en el LDLc). Los ratones deficientes en Ldlr (receptor de LDL), con alto contenido de apoB-100, disminuyeron los niveles del LDLc en 62%. Los niveles de las lipoproteínas de alta densidad (HDL [high-density lipoprotein]) disminuyeron en los ratones C57BL/6 con dieta normal, 48% en los que recibieron dieta hipergrasa y 14% en los deficientes en Ldlr. La atorvastatina también redujo los niveles de la HDL. Se ha sugerido que las partículas HDL maduras requieren componentes de las lipoproteínas con contenido de apoB.

Seguridad luego de la reducción de los niveles de la apoB-100

Para controlar la hepatotoxicidad se cuantificaron los niveles de las transaminasas. Los niveles de la aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa en los ratones tratados con ASO y que recibieron dietas ricas en grasas fueron similares a los observados en los controles (ASO 25 mg/kg, atorvastatina y solución fisiológica). La inhibición farmacológica de la apoB-100 debería bloquear la secreción de triglicéridos desde los hepatocitos y, potencialmente, causar esteatosis, que no pudo observarse con los modelos experimentales utilizados. Asimismo, el tratamiento con ASO no presentó efectos sobre la absorción del ácido oleico radiomarcado, lo cual coincidió con que no se alteraron los niveles de la apoB-48 intestinales.

Algunos estudios han sugerido que determinados genes involucrados en la biosíntesis del colesterol y los ácidos grasos se regulan por disminución tras la reducción de la apoB-10, como los de la estearoil CoA desaturasa, lipasa hepática, la proteína 2 de unión a los ácidos grasos y la proteína 1 de unión al elemento de respuesta a esteroles. Asimismo, los niveles de la ácido graso sintetasa se redujeron después de 1 semana de tratamiento con la aplicación de ASO. También se observó que aumentaron los niveles del ARNm de la proteinquinasa activada por el AMP que, cuando se regula en forma positiva, disminuiría la biosíntesis de colesterol y ácidos grasos.

Discusión

Si bien el ISIS 147764 ha demostrado ser una molécula efectiva en los modelos murinos, la biología del colesterol varía en forma significativa en los seres humanos y las perspectivas terapéuticas de los ASO deberán establecerse a través de ensayos clínicos adecuados. En este sentido, el inhibidor de la apoB-100 humana -ISIS 301012- se evalúa en ensayos clínicos de fase I. Algunos datos preliminares tomados de dichos estudios muestran que el fármaco redujo de manera segura colesterol total, VLDL, LDLc y apoB-100 sérica en voluntarios sanos.

La información proveniente del National Cholesterol Education Program Adult Treatment III demuestra que los objetivos respecto de los niveles del LDLc no siempre se alcanzan y las tasas de mortalidad cardiovascular todavía son elevadas, en especial en los pacientes de alto riesgo. Por lo tanto, el mejor entendimiento de las bases moleculares de los tipos de dislipidemias que afectan a aquellas lipoproteínas con alto contenido en apoB aterogénica debe relacionarse con el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, como los inhibidores antisentido de la apoB-100.

En conclusión, el ISIS 147764 redujo en forma efectiva y segura la apoB-100 en varios modelos de hiperlipidemia murina. Sus propiedades farmacológicas hacen de este agente una alternativa interesante para el tratamiento hipolipemiante, aplicado solo o en combinación con otros fármacos. Los pacientes que más podrían beneficiarse con estas nuevas drogas son aquellos resistentes al tratamiento con estatinas y los expuestos a un riesgo elevado de enfermedad cardiovascular (diabetes y síndrome metabólico), concluyen los autores.