La Proteína de Unión al Elemento de Respuesta a los Esteroles Regula la Expresión del Gen de la Ciclooxigenasa-2 en el Endotelio

• AUTOR : Smith LH, Petrie MS, Morrow JD y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : The Sterol Response Element Binding Protein Regulates Cyclooxygenase-2 Gene Expression in Endothelial Cells
• CITA : Journal of Lipid Research 46(5):862-871, May 2005
• MICRO : Este estudio muestra cómo el colesterol regula la expresión genética de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) a través de procesos metabólicos que involucran factores transcripcionales como la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles.

Diversos estudios han demostrado que el aumento de los niveles de la lipoproteína de baja densidad (LDL [low-density lipoprotein]) es un factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad cardiovascular vinculada a las alteraciones del endotelio. La vasodilatación dependiente del endotelio está regulada por la actividad del óxido nítrico, la prostaciclina (prostaglandina I2, PGI2) y el factor hiperpolarizante dependiente del endotelio. La PGI2 se sintetiza por la forma inducible de la ciclooxogensa, la ciclooxigenasa-2(COX-2).

La proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles (SREBP [sterol response element binding protein]) es un factor de transcripción dependiente de los lípidos, del cual no se conoce con exactitud su función sobre la expresión de genes en los tejidos extrahepáticos. La concentración del colesterol se mantiene a través de la endocitosis de las lipoproteínas plasmáticas mediada por el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR [low-density lipoprotein receptor]) y la síntesis de novo a través de la vía del mevalonato. Cuando la colesterolemia disminuye, la SREBP aumenta la expresión del LDLR y las enzimas de la vía del mevalonato.

En este artículo, los autores comunican que las células endoteliales expresan la SREBP y que esta proteína en el nivel transcripcional regula en forma directa la COX2 endotelial.

Resultados

Las células endoteliales de la vena umbilical humana expresan la SREBP funcional

Para evaluar si la SREBP regula la expresión del gen de la COX-2, primero se analizó si las células endoteliales vasculares expresan dicha proteína. La presencia de la SREBP se manifestó con anticuerpos monoclonales contra el dominio de unión al ADN de la SREBP humana. El precursor inactivo de la SREBP se halló en el retículo endoplásmico (ER) a través de anticuerpos específicos contra la proteína específica del ER, isomerasa disulfuro y visualizados a través de procedimientos de inmunofluorescencia. También se determinó la expresión de la proteína activadora del clivaje de la SREBP, que se localizó dentro del ER. Los estudios de western blotting mostraron que un precursor de 125 KDa de la SREBP estuvo presente en las células endoteliales de la vena umbilical humana.

La incubación de estas células en un medio privado o deficiente en colesterol activó la SREBP, según se dedujo por la presencia de una SREBP nuclear más pequeña (64 kDa).

Análisis e identificación de las secuencias que confieren la regulación del colesterol sobre el promotor de la COX-2

Un estudio previo de los autores mostró que la regulación de la expresión del gen de la COX-2 por parte del colesterol tenía lugar en el nivel transcripcional. Para establecer el efecto del colesterol sobre el promotor de la COX-2 se obtuvo un plásmido reporter de la luciferasa, el cual contenía 7.2 Kbp del promotor de la COX-2 humana. La actividad de este «constructo» (-7.2COX-2Luc) fue mayor cuando no hubo colesterol en el medio y disminuyó 73% con el agregado de 10 mcg/ml de colesterol exógeno libre.

Cuando el constructo fue cotransfectado con un CMV-SREBP-1A-460, el cual codifica sólo los dominios de unión al ADN y los de transactivación de la SREBP-1, la SREBP -activa en su constitución- aumentó la actividad de la luciferasa 5 veces, en comparación a las células transfectadas con el vector vacío. Así, el colesterol a través del promotor regula la expresión del gen de la COX-2, por lo que la SREBP resulta suficiente para aumentar la actividad de dicho promotor.

Luego se analizaron las secuencias reguladoras del sentido 5′ de la COX-2 humana para establecer la presencia de un elemento de respuesta a los esteroles (SRE [sterol response element]).

Para localizar los elementos reguladores que median los efectos de la SREBP, se obtuvieron series de deleciones 5′ progresivas del promotor de la COX-2 y sus actividades se cuantificaron en experimentos de transfección con y sin colesterol o en combinación con las CVM-SREBP-1A-460 cotransfectadas.

La deleción de hasta -450 bp no disminuyó la sensibilidad de estos constructos al colesterol. Sin embargo, la deleción de hasta -327 bp, que remueve el motivo SRE localizado en -422 bp, disminuyó 60% la actividad de la luciferasa. Se obtuvieron resultados similares cuando las células fueron cultivadas en medios ricos en colesterol y cotransfectados con la SREBP constitucionalmente activa. Estos datos muestran la presencia del dominio regulador de esteroles en una región localizada de -459 bp a -327 bp del promotor de la COX-2.

Luego se generaron 2 plásmidos mutantes, que se confirmaron por análisis de endonucleasas de secuenciación y restricción. El primer mutante cambió 3 residuos que antes se identificaban como determinantes de la unión de la SREBP a su elemento de respuesta.

La segunda mutante se diseñó para aumentar la inducción dependiente de la SREBP del constructo del promotor de la COX-2 al convertir el COX-2 SRE en el LDLR-SER canónico.

La activación diferencial del constructo del promotor de la COX-2 por parte de la SREBP-1 y la SRBP-2

Las 2 isoformas de la SREBP activaron al promotor p459COX-2Luc en forma dependiente de la concentración, y la SREBP-1 sería un activador más potente de este promotor que la SREBP-2.

SREBP-1 y SREBP-2 forman complejos específicos con el COX-2 SER

Para determinar si la SREBP se une en forma directa a un sitio putativo del COX-2 SRE (ATCAGTCCACA en -422 bp) se llevó a cabo un ensayo de electromovilidad por saltos. Se probaron las SREBP-1A-460 y SREBP-2-468 recombinantes en función de su capacidad de interactuar in vitro con esta secuencia a través de una sonda ADN que contiene 3 repeticiones en tándem del COX-2 SRE, con cada SRE putativo separado por 6 bp (designado COX-2 SRE y la sonda ADN con las 3 repeticiones de esta secuencia designada como COX-2 SRE 3X).

La SREBP-1A-460 incubada con la COX-SRE3X resultó en la formación de 3 complejos de ADN y proteínas con diferentes movilidades. El complejo 1 representó la interacción entre el COX-SRE3X y la albúmina sérica bovina, de características no específicas y que sirvió como control. El complejo 2 fue similar al anterior y el 3 constituyó una interacción ADN-proteínas específica entre la SREBP y el oligonucleótido COX-2SRE3X.

El COX-2 SRE compite en forma efectiva con el LDLR SRE por los complejos SREBP

La unión de la SREBP al COX-2 SRE se mostró por la competición de una sonda que contenía al SRE promotor del LDLR. El aumento de los niveles del COX-2 SRE no marcado redujo la intensidad de los complejos SREBP/LDLR de manera dependiente de la concentración. La sonda LDLR compitió en forma más efectiva que la sonda COX-2 y sugirió que el promotor de esta última posee menos afinidad por la SREBP que el LDLR.

La lovastatina aumenta la producción endotelial de PGI2 e induce la expresión de la COX-2

La exposición de las células endoteliales de la vena umbilical humana a la lovastatina, un inhibidor de la HMG-CoA-reductasa, aumentó la producción de prostaciclinas y la actividad de la luciferasa en las células transfectadas con el p459COX-2Luc en forma dependiente de la concentración. Por el contrario, las células transfectadas con el promotor -327COX-2 que carecía del SRE no fue afectado por el tratamiento con dicho fármaco, el cual, por otra parte, aumentó la producción endotelial del ARNm de la COX-2.

Discusión

Aunque los autores mostraron que la producción endotelial de la COX-2 y su ARNm se induce con la depleción del colesterol, este estudio extiende estas conclusiones al mostrar que dicha privación activa al promotor de la COX-2 humana en las células endoteliales transfectadas de manera temporal. Por otra parte, se identificó una secuencia altamente conservada a -422 bp del sitio del comienzo transcripcional del promotor de la COX-2, correspondiente al SRE y la cual formó complejos específicos con la SREBP-1a y SREBP-2, además de ser un competidor efectivo de la unión de la SREBP al LDLR SRE.

Por último, las drogas capaces de inhibir competitivamente la HMG-CoA reductasa, como la lovastatina, activan en forma indirecta a la SREBP al disminuir la síntesis intracelular del colesterol.

Se debe tener en cuenta que la regulación de la expresión de la COX-2 en el contexto de procesos como la aterosclerosis es mucho más compleja. Este estudio refleja la actividad endotelial en ausencia de muchos factores de confusión como la regulada por las células del músculo liso, plaquetas, macrófagos y las señales inflamatorias, en particular las citoquinas.

En conclusión, esta investigación muestra cómo el colesterol regula la expresión genética de la COX-2 a través de procesos metabólicos que involucran a la SREBP y sustenta que la terapia hipocolesterolemiante, al contribuir con el aumento de la síntesis endotelial de prostaciclinas, resulta beneficiosa independientemente del efecto que fármacos como las estatinas ejercen sobre el metabolismo lipídico.

Especialidad: Bibliografía - Clínica Médica