Posible Blanco Farmacológico Para el Tratamiento de la Miocardiopatía Diabética

• AUTOR : Roe N, Thomas D, Ren J y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Inhibition of NADPH Oxidase Alleviates Experimental Diabetes-Induced Myocardial Contractile Dysfunction
• CITA : Diabetes, Obesity and Metabolism 13(5):465-473, May 2011
• MICRO : Demuestran que la actividad de la NADPH oxidasa en la diabetes inducida en ratones fue responsable del aumento del estrés oxidativo, los niveles de óxido nítrico y peroxinitritos, que llevan a la disfunción contráctil, y que su inhibición con apoquinina restaura la función cardíaca apropiada.

Introducción

De todas las complicaciones de la diabetes, la enfermedad cardiovascular permanece como la causa más importante de morbilidad y mortalidad. Si bien todos los diabéticos tienen mucho mayor riesgo de enfermedad coronaria e hipertensión, la miocardiopatía diabética puede producirse independientemente del compromiso macrovascular y microvascular y modifica la geometría y función del miocardio. Incluso en los pacientes con buen control de la glucemia, puede haber hipertrofia ventricular y disfunción diastólica y sistólica debido a diabetes crónica. La enfermedad produce una reducción de la máxima velocidad de contracción y relajación de los cardiomiocitos, una reducción máxima de la amplitud contráctil y una prolongación del tiempo de relajación del músculo cardíaco. No existe una terapia específica para la miocardiopatía diabética, sino que el manejo clínico actual apunta, fundamentalmente, al control de la hiperglucemia y al retardo del remodelado cardíaco. Datos recientes sugieren el papel fisiopatogénico de la acumulación de anión superóxido (O2-) y especies reactivas del oxígeno (ERO), aunque no se ha esclarecido del todo el mecanismo preciso. En el corazón del paciente diabético, hay muchas fuentes de O2- y ERO, y recientemente se propuso a la NADPH oxidasa como la fuente principal de O2-. Otros estudios plantearon que la activación de esta enzima y la generación de ERO a nivel mitocondrial podrían cumplir un papel crucial. También, se propuso que la diabetes puede generar el desacoplamiento de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), que produce O2- en lugar de óxido nítrico (NO). Hay varias teorías del mecanismo de este desacoplamiento, como una menor asociación de HSP90, cambios en el estado de fosforilación de eNOS o la oxidación de tetrahidrobiopterina, cofactor esencial de eNOS, en respuesta a O2-, ERO o peroxinitrito.

Para comprender mejor el papel de la NADPH oxidasa en la miocardiopatía diabética, este estudio se diseñó para evaluar si el O2- derivado de esta enzima es el disparador de la disfunción contráctil de la diabetes.

Métodos

Se indujo diabetes en ratones de experimentación mediante una inyección simple de estreptozotocina (STZ) diluida en un buffer de citrato, hasta generar una glucemia > 250 mg/dl. Se los mantuvo durante 2 semanas, luego de las cuales se los dividió en dos grupos; uno recibió apoquinina, inhibidor de la NADPH oxidasa, en agua de beber, mientras que al otro se le dio agua en cantidades diarias equivalentes. Después, se los mantuvo dos semanas más, con libre acceso a comida y agua, y se les midió el peso corporal y la glucemia.

Se evaluó la geometría y la función cardíaca en ratones anestesiados mediante un ecocardiograma en dos dimensiones en modo M, donde se registró el grosor anterior y posterior de la pared y las dimensiones sistólicas y diastólicas del ventrículo izquierdo.

Para el aislamiento de los cardiomiocitos se sedó a los animales con ketamina/xilazina, se removieron los corazones para perfundirlos en una solución bicarbonatada de Krebs-Henseleit. Los corazones se absorbieron durante 15 minutos, se removieron y se picaron los ventrículos izquierdos, y se repuso lentamente el Ca2+ a una concentración de 1.25 mm. Solo se usaron para el estudio los cardiomiocitos con márgenes libres, pero sin contracciones espontáneas.

Luego, se evaluaron las propiedades mecánicas de los cardiomiocitos mediante estimulación eléctrica. Se evaluó el acortamiento celular y el alargamiento por medio de índices, tales como el máximo de acortamiento de las miofibrillas.

Se llevó a cabo la medición intracelular de O2- y se realizó el análisis de Western Blot para evaluar diversas proteínas, tales como Akt, AMPK, HSP90 y eNOS. Se midió la biodisponibilidad de NO mediante la medición de nitrito y nitrato.

Resultados

Respecto de las características morfométricas, el peso corporal era significativamente menor en los ratones diabéticos en comparación con el grupo control, efecto que no se vio afectado por el tratamiento con apoquinina. Los pesos de los órganos no variaban de manera significativa entre los grupos y, como era de esperarse, la glucemia de los ratones tratados con STZ se elevó de forma significativa, lo que no fue afectado tampoco por la apoquinina.

Para evaluar si la NADPH oxidasa es la fuente primaria de O2- en los corazones diabéticos, y así un posible blanco de intervención farmacológica, los corazones de los ratones con diabetes inducida se incubaron in vitro con apoquinina durante 1 hora. Los datos demuestran que los cardiomiocitos de los ratones diabéticos tenían una mayor generación de O2-, efecto que se atenuó con la incubación con apoquinina. La administración de apoquinina por sí misma no afectó la producción de O2- en los cardiomiocitos de los ratones controles.

Los datos ecocardiográficos revelaron que la diabetes experimental redujo significativamente el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo y su grosor, sin afectar su diámetro de fin de sístole y diástole. El tratamiento con apoquinina anuló la disminución del acortamiento fraccional inducida por la diabetes, pero no afectó los cambios de la geometría del miocardio inducidos por esta (grosor de la pared y diámetros de fin de sístole y diástole).

En cuanto a las propiedades contráctiles, la diabetes inducida por STZ tuvo poco efecto en la longitud de la célula en reposo. En concordancia con informes previos, la diabetes experimental redujo significativamente el máximo de acortamiento y la máxima velocidad de acortamiento y alargamiento, acompañado de prolongación del tiempo de acortamiento y alargamiento, efectos que fueron revertidos de forma eficaz con la apoquinina.

En estudios previos se observó que las Akt y AMPK, moléculas de señalización que controlan la geometría y función cardíacas, están comprometidas por la diabetes. Los resultados de este trabajo indicaron que la fosforilación de AMPK disminuyó significativamente en los corazones de los ratones tratados con STZ, efecto que la apoquinina no modificó, mientras que la fosforilación de Akt no se vio afectada por la STZ. Así como hay datos previos que sugieren que en los corazones diabéticos hay una regulación negativa de las proteínas reguladoras del Ca2+ SERCA2 y fosfolambán, esenciales para la recaptación de Ca2+ durante el acoplamiento excitación-contracción, en este estudio se encontró que la diabetes disminuyó la expresión de SERCA2 y la fosforilación de fosfolambán, efecto que no pudo ser modificado por la apoquinina.

Para evaluar la posible contribución del desacoplamiento de eNOS a la producción de O2- en la diabetes, se incubaron los cardiomiocitos de cada grupo de ratones con el inhibidor de NOS L-NAME durante 2 horas. Los datos demostraron que este inhibidor ejerció poco efecto en los cardiomiocitos del grupo control, aunque el aumento de O2- inducido por STZ en los corazones diabéticos fue atenuado por L-NAME. Más aún, el inhibidor de NOS no afectó la síntesis de O2- de los cardiomiocitos de los ratones diabéticos tratados con apoquinina. Esto sugiere la presencia del desacoplamiento de eNOS en la diabetes que promueve la generación de O2-. No se identificó un papel significativo del HSP90 en este fenómeno. También se encontró que el tratamiento con apoquinina es beneficioso en cuanto al desacoplamiento del eNOS.

Discusión y conclusiones

Los resultados demuestran que la NADPH oxidasa cumple un papel crucial en la aparición de la disfunción cardíaca en la diabetes y, entonces, puede ser un blanco para un posible tratamiento de la miocardiopatía diabética. La inhibición de esta enzima tuvo un efecto mínimo en la glucemia, lo que implica que el efecto beneficioso no depende de una posible acción hipoglucemiante de la apoquinina. La observación de que esta inhibición hecha in vitro atenúa significativamente la generación de O2- favorece la idea de que la NADPH oxidasa sea una fuente importante de O2- en lo animales diabéticos. En cuanto a las alteraciones de la mecánica de los cardiomiocitos, ya mencionadas, la inhibición de la NADPH oxidasa con apoquinina pudo revertir la disfunción contráctil, pero tuvo poco efecto sobre la geometría cardíaca.

Los resultados también permiten inferir que el estrés cardíaco oxidativo derivado de la NADPH oxidasa parece ser responsable del desacoplamiento de la eNOS. Esto es apoyado por el hecho de que la inhibición de la NADPH oxidasa fue suficiente para eliminar la producción de O2- dependiente de eNOS. El análisis de los factores de desacoplamiento de eNOS independientes del estrés oxidativo determinó que era improbable la responsabilidad de la fosforilación de eNOS o HSP90 para desencadenarlo. Por lo tanto, si bien el estudio aportó datos contundentes que demuestran que la NADPH oxidasa podría ser el disparador primario de estrés oxidativo, debe tomarse con precaución, ya que esta enzima podría no ser la única fuente de O2- en los corazones diabéticos.

Si bien se han implicado varios factores distintos del estrés oxidativo en la aparición de la miocardiopatía diabética, como cambios ultraestructurales, productos de la glucosilación avanzada y lipotoxicidad, estudios previos en ratones transgénicos con sobreexpresión de antioxidantes demostraron el papel crucial del O2- y las ERO. Este trabajo refuerza aun más la hipótesis de la miocardiopatía diabética por O2-, pero señala a la NADPH oxidasa como su fuente. Si bien otros datos revelaron el papel de la hipertrofia y la fibrosis, los resultados de este estudio demuestran un menor grosor de la pared en diástole, en concordancia con estudios previos. Es probable que esto se deba a la corta duración de la inducción de diabetes; 4 semanas de diabetes mellitus podrían ser insuficientes para inducir cambios estructurales en el corazón.

Los menores niveles de SERCA2a encontrados en el miocardio de los ratones diabéticos están en la misma línea conceptual de una menor fosforilación de fosfolambán, lo que concuerda con otros estudios. Estas dos proteínas son las encargadas de regular la concentración de Ca2+ y la función diástolica; los resultados demostraron que SERCA2a y fosfolambán cumplen un papel en la contractilidad cardíaca y la desregulación intracelular de Ca2+ en el contexto de diabetes inducida por STZ. Sin embargo, la falta de efecto de la apoquinina en estas proteínas alteradas en presencia de mejoría de la función contráctil parece descartarlas como posibles responsables del efecto protector de la apoquinina en el corazón diabético. Cabe mencionar que estas SERCA2a y fosfolambán son sensibles al estado de óxido-reducción, por lo que la apoquinina podría ser responsable de compensar sus modificaciones al disminuir el estado de oxidación intracelular.

En cuanto a la causa del desacoplamiento de eNOS, fenómeno observado en otros trabajos sobre la diabetes mellitus, a partir de los resultados se sugiere que la fosforilación de eNOS y los niveles de HSP90 cumplen un papel ínfimo. En todo caso, se apunta a un mecanismo de óxido-reducción, ya sea la oxidación de tetrahidrobiopterina o la disrupción del complejo zinc-tiolato por peroxinitrito. Se vio que la inhibición de la NADPH disminuyó los niveles de peroxinitritos y la producción de superóxido en el corazón. El tratamiento con STZ alteró la cascada de señalización de Akt y AMPK, pero los autores deducen que es probable que ambas no estén involucradas en el efecto beneficioso de apoquinina sobre el miocardio.

Los investigadores concluyen señalando que la actividad de la NADPH oxidasa en la diabetes fue responsable del aumento del estrés oxidativo, los niveles de NO y de peroxinitritos que llevan a la disfunción contráctil y que su inhibición restaura la función cardíaca apropiada. Todos estos datos permiten sugerir que una terapia que tome esta enzima como blanco podría ser la opción del tratamiento de la disfunción cardíaca en la diabetes.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología