El Alcohol Incrementa el Factor de Necrosis Tumoral Alfa y Disminuye el Factor Nuclear KappaB para Activar la Apoptosis Hepática en Ratones Genéticamente Obesos

• AUTOR : Robin MA, Demeilliers C, Sutton A y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Alcohol Increases Tumor Necrosis Factor Alpha and Decreases Nuclear Factor-KappaB to Activate Hepatic Apoptsis in Genetically Obese Mice
• CITA : Hepatology 42(6):1280-1290, Dic 2005
• MICRO : En ratones genéticamente obesos, la ingesta moderada de alcohol no incrementa el estrés oxidativo pero desencadena los efectos apoptóticos del factor de necrosis tumoral alfa.

Introducción

Los factores que incrementan el daño hepático en los individuos que ingieren grandes cantidades de alcohol se relacionan con el sexo, la edad, la duración del abuso de alcohol y la obesidad. Las lesiones hepáticas que pueden ocasionar la intoxicación con alcohol y la obesidad son la esteatosis, la esteatohepatitis, la fibrosis y la cirrosis. Además, incrementan la formación de especies reactivas del oxígeno y favorecen la peroxidación de lípidos, la disfunción mitocondrial y la formación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa).

Los hepatocitos normales expresan Fas pero no su receptor y el alcohol incrementa ambos. Junto con el TNF-alfa activan a la caspasa 8. La señal que activa la muerte celular por caspasa 8 es débil pero puede amplificarse con la liberación de citocromo c desde las mitocondrias al citoplasma.

Los ratones ob/ob tienen déficit de leptina, por ello presentan obesidad mórbida, resistencia a la insulina y esteatosis hepática masiva. A nivel hepático se observa necrosis y apoptosis acompañadas de un infiltrado inflamatorio leve; no así fibrosis, porque la ausencia de leptina impide la fibrinogénesis. En los hepatocitos de los ratones ob/ob se observa una activación incrementada del factor nuclear kappaB que inhibe la apoptosis a través de la inducción de factores antiapoptóticos. En un trabajo reciente, a los ratones ob/ob se les administró una dosis de etanol o una dosis de etanol más lipopolisacárido bacteriano, sustancia a la que son muy sensibles. No se informaron lesiones hepáticas, sólo un infiltrado inflamatorio en los animales con la dosis combinada.

En este estudio, los autores compararon los efectos hepáticos de la administración de dosis de etanol clínicamente relevantes en ratones ob/ob y ratones delgados.

Materiales y métodos

Se utilizaron ratones machos jóvenes, con un peso entre 49 y 56 g y otro grupo de ratones machos jóvenes y delgados con un peso entre 26 y 30 g. El etanol se diluyó en el agua de bebida (50:50) y se les administró por intubación gástrica una vez al día durante 4 días consecutivos. Finalizados los 4 días se sacrificaron a las 2 horas de la última dosis. En el grupo de ratones obesos se administró pentoxifilina por vía intraperitoneal (100 mg/kg) una hora antes de cada administración de etanol. El grupo placebo recibió sólo agua. El pretratamiento con pentoxifilina en ratones obesos evita el incremento del TNF-alfa en plasma inducido por etanol. En resumen, los grupos estudiados fueron ratones delgados con intoxicación con etanol o sin ella, ratones obesos con intoxicación con etanol o sin ella y un grupo especial con pretratamiento con pentoxifilina.

Una vez sacrificados, se les extrajo plasma y se determinaron los niveles de etanol, de TNF-alfa, la actividad de alanina aminotransferasa (AAT) y el nivel antioxidante plasmático total.

El hígado fue separado en 2 partes: una sección fue fijada en formol, incluida en parafina y se realizaron cortes teñidos con hematoxilina para evaluar los cambios histológicos. Se efectuó un conteo del número de hepatocitos que presentaban depósitos de grasa. La necrosis con infiltrado polimorfonuclear se registró sólo como presente o ausente. Otras secciones hepáticas fueron homogeneizadas para evaluar la fase de lípidos y triglicéridos. La cuantificación se realizó por espectrofotometría. La apoptosis se detectó in situ con el método de TUNEL y se clasificó como – (negativa), + (levemente positiva), ++ (fuertemente positiva). En secciones de hígado congeladas se realizó inmunohistoquímica con el método de peroxidasa/antiperoxidasa con anticuerpos monoclonales para caspasa 3. Los resultados se clasificaron como – (negativa), + (levemente positiva), ++ (fuertemente positiva).

Las fracciones subcelulares hepáticas se aislaron por gradiente y se separaron las fracciones citosólica y mitocondrial. Se midió la actividad de caspasa 3, la permeabilidad transicional de la mitocondria y la valoración del citocromo c. También se determinaron los niveles de glutatión hepático, la peroxidación de lípidos, la presencia de grupos carbonilos en las proteínas y el nivel de ADN mitocondrial. Además, se estableció la actividad de superóxido dismutasa (SOD), de las enzimas relacionadas con glutatión y del sistema enzimático citocromo p450 2E1. Se analizó la expresión de proteína de choque térmico 70, de la óxido nítrico sintetasa inducible, del c-IAP2, del Bcl-xa, del kappaBalfa inhibidor, del p65 NF-kappaB y de la actividad de unión al ADN del p65 NF-kappaB. En general, para estas determinaciones se utilizan equipos de reactivos comprados específicamente para cada una.

El análisis estadístico se realizó con ANOVA y seguidamente la prueba de Fisher. Cuando se compararon 2 grupos solos se utilizó la prueba de t. Los resultados se expresaron como media + error típico de la media. El valor significativo para p < 0.05.

Resultados

Las concentraciones de etanol en plasma a las 2 horas de la última dosis fueron similares en ambos grupos de ratones. Respecto de la histología hepática, 6 ratones controles delgados no presentaron lesiones hepáticas o resultado positivo con el método de TUNEL; de los 7 ratones delgados intoxicados sólo 1 mostró esteatosis leve y 4 resultado positivo del ensayo de TUNEL. En los ratones obesos controles todos manifestaron esteatosis macrovacuolar masiva, 3 tenían inflamación y necrosis y 3 resultado positivo del método de TUNEL. En los 7 ratones obesos intoxicados todos presentaron esteatosis masiva y 6 resultado positivo del TUNEL pero sin necrosis o inflamación, lo que indicó que un resultado positivo para el método del TUNEL se debe a la existencia de células apoptóticas.

Respecto de los lípidos hepáticos, en los ratones ob/ob sólo se observó disminución en los triglicéridos de los animales tratados con pentoxifilina. La actividad de AAT se incrementó hasta 5 veces en los ratones obesos ob/ob tratados y no tratados con etanol en comparación con los animales delgados con tratamiento o sin él. La pentoxifilina suprimió la actividad de AAT en los ratones obesos que habían ingerido etanol.

La actividad de caspasa 3 no se modificó en ninguno de los grupos de ratones delgados. Respecto de los animales obesos, en 1 de 6 controles y en los 7 intoxicados se observó un incremento de la actividad de caspasa 3. De nuevo la pentoxifilina suprimió la respuesta en los animales obesos.

Los valores plasmáticos de TNF-alfa sólo se incrementaron en los ratones obesos con etanol, donde se observó el mayor incremento de su concentración. El pretratamiento con pentoxifilina abrogó este aumento. En los ratones obesos tratados con etanol, el nivel sérico elevado de Ikappa B se incrementó en el citoplasma, pero los niveles de factor nuclear kappaB y del p65 NF-kappaB disminuyeron significativamente. Estos efectos fueron inducidos por el etanol pero no se observaron en los ratones pretratados con pentoxifilina. El incremento de TNF-alfa y la menor actividad del factor nuclear kappaB en los ratones obesos que fueron intoxicados con etanol resultan en un incremento de la apoptosis hepática.

Se observó un 55% de incremento en el nivel del citocromo c en las mitocondrias de los ratones obesos controles pero no en los controles delgados. La administración de etanol no modificó esta diferencia. Es interesante destacar que el nivel de citocromo c citoplasmático no se modificó en ninguno de los 4 grupos de animales.

La intoxicación con etanol puede aumentar la producción de especies reactivas del oxígeno, a su vez, éstas inducen la SOD mitocondrial e inactivan al glutatión, que favorece el estrés oxidativo y la producción de proteína de choque térmico 70. En los ratones obesos controles la actividad de la SOD mitocondrial se incrementó, valor que no se modificó en el grupo de ratones obesos intoxicados con etanol. Los valores de glutatión oxidado o reducido citosólico o mitocondrial no se modificaron en los ratones controles obesos o delgados. La administración de etanol disminuyó los niveles de glutatión reducido en los animales delgados con intoxicación con etanol, pero tuvo poco efecto sobre los animales obesos intoxicados. El glutatión reducido citosólico no se modificó en los diferentes grupos de animales, mientras que el mitocondrial se incrementó en los ratones delgados intoxicados, sin modificarse en los obesos tratados. La pentoxifilina no modificó los valores de glutatión.

Los niveles de proteína de shock térmico 70 aumentaron de grupo en grupo en el orden siguiente: ratones delgados controles, ratones delgados intoxicados, ratones obesos controles y ratones obesos intoxicados.

Discusión

La obesidad incrementa el riesgo y la gravedad de las lesiones hepáticas en quienes consumen alcohol, en tanto que el consumo moderado de alcohol aumenta el riesgo de enfermedad hepática en obesos. Para poder discernir los mecanismos fisiopatológicos involucrados, los autores compararon el efecto del etanol en ratones delgados y obesos. Se observaron mayores niveles plasmáticos de AAT, mayor actividad de caspasa 3 y mayor cantidad de hepatocitos con técnica de TUNEL positiva en los hígados de los ratones obesos intoxicados con etanol. La prueba de TUNEL se positiviza tanto en células apoptóticas como necróticas, pero en los ratones obesos intoxicados se observó TUNEL positivo en casi todos los animales pero sólo en 1 se identificó un patrón de necrosis, lo que asegura que una prueba del TUNEL positiva identifica hepatocitos apoptóticos.

Respecto del estrés oxidativo, se advirtió un leve incremento en los ratones delgados y obesos controles, pero estos parámetros no se modificaron luego de la intoxicación con etanol en ambos grupos. Estos datos sugieren que el etanol incrementa la muerte celular de los hepatocitos por apoptosis pero sin aumentar el estrés oxidativo. Los resultados de los autores sugieren que el incremento del TNF-alfa puede ser un evento fundamental para disparar el mecanismo de apoptosis en ratones obesos intoxicados con etanol, aunque habría otros factores proapoptóticos involucrados.

En los ratones obesos se observó que el incremento de la actividad de SOD mitocondrial se acompaña de una reducción de la actividad de glutatión reducido de localización mitocondrial. Esto conduce a una desintoxicación deficiente del peróxido de hidrógeno en la mitocondria con necrosis subsiguiente. Sin embargo, la disminución de los niveles de la actividad de NF-kappaB podría prevenir esta toxicidad del peróxido de hidrógeno.

La fibrosis requiere de la leptina como sustancia facilitadora de su producción, al ser los ratones obesos deficientes en leptina no se observa fibrosis. Este dato explica que el patrón que se observa en seres humanos sea diferente. Al contener niveles normales de leptina puede observarse fibrosis en los hígados de los pacientes obesos que consumen etanol.

Las adaptaciones observadas en los ratones obesos involucran: 1) incremento en la actividad de SOD mitocondrial; 2) aumento del nivel de citocromo c mitocondrial; 3) aumento de los niveles de ADN mitocondrial; y 4) la mayor síntesis de proteína de shock térmico 70. Estos datos concuerdan con otros trabajos previos de otros autores.

Conclusión

Los ratones obesos desarrollaron un incremento en la superóxido dismutasa mitocondrial, en la proteína de shock térmico 70, en el citocromo c mitocondrial y en el ADN mitocondrial que limitarían el estrés oxidativo. Por ello, la ingesta de niveles moderados de etanol en estos animales no incrementa el estrés oxidativo pero aumenta los valores de TNF-alfa y disminuye los de la proteína nuclear kappaB, que desencadena apoptosis. Según los autores, la mayor activación de caspasa 3 en los ratones obesos intoxicados se correlacionó con mayor grado de apoptosis al compararlos con los ratones obesos controles.

Especialidad: Bibliografía - Gastroenterología