La Progesterona Regula la Expresión del HLA-G in Vitro y Podría Inducir Tolerancia Inmunológica

• AUTOR : Yie S, Li L, Li G y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Progesterone Enhances HLA-G Gene Expression in JEG-3 Choriocarcinoma Cells and Human Cytotrophoblasts in Vitro
• CITA : Human Reproduction 21(1):46-51, Ene 2006
• MICRO : Los efectos de la progesterona sobre la expresión de HLA-G observados in vitro podrían explicar los efectos inmunomoduladores de esta hormona sobre la tolerancia inmunológica materna al embarazo.

Introducción

La forma en la que la unidad feto placentaria (UFP) evita el rechazo inmunológico materno cuando se trata de un semiinjerto que, de alguna manera, «escapa» a la respuesta inmune permanece como un interrogante básico para la inmunología reproductiva. Es probable que las células trofoblásticas de la placenta cumplan un papel importante, dado que son las únicas de la UFP en contacto directo con los tejidos maternos. Las células multinucleadas del sinciciotrofoblasto recubren las vellosidades coriónicas «flotantes», bañadas por sangre materna, mientras que las células citotrofoblásticas (CCT) extravellositarias invaden la capa decidual del útero y llegan a los vasos maternos, en los que reemplazan a las células endoteliales. Las células del sinciciotrofoblasto no expresan antígenos del sistema HLA, pero en el citotrofoblasto sí se observa la expresión de antígenos no clásicos clase I y de HLA-G, que también pueden hallarse en un número limitado de tejidos, como los ovocitos, embriones en inicio del desarrollo y monocitos activados. Las características particulares del HLA-G han conducido a la hipótesis de que desempeñaría un papel relevante en la inmunotolerancia materna al feto, ya que evidencias experimentales sugieren que el HLA-G, en las membranas y en su forma soluble, podría proteger a la UFP de la lisis por células natural killer (Kovats y colaboradores, 1991; Chumble y colaboradores, 1994; McMaster y colaboradores, 1995), así como de la actividad citotóxica de células T (Deniz y colaboradores, 1994; Kapasi y colaboradores, 2000); sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión del gen del HLA-G son, hasta el momento, poco conocidos.

La progesterona es una hormona esteroidea esencial para el mantenimiento de la gestación, a la que se le atribuyen diversas funciones: estimulación del crecimiento y diferenciación del endometrio para permitir la implantación, inhibición de las contracciones miometrales e inducción de inmunotolerancia al feto. Los autores del presente trabajo propusieron la hipótesis de que la progesterona actuaría a través de la modulación de la expresión génica del HLA-G a nivel placentario y, para evaluar esta posibilidad, estudiaron los efectos de la progesterona sobre la expresión de antígenos HLA-G en cultivos celulares de CCT del primer trimestre y de una línea de células de coriocarcinoma denominada JEG-3.

Material y métodos

Cultivos celulares. Las células JEG-3 comparten diversas características con las CCT, como la expresión de HLA-G; estas células, al igual que las CCT obtenidas de especímenes de abortos de primer trimestre, fueron cultivadas en condiciones adecuadas para investigar la expresión de proteínas HLA-G y de ARNm.

Experimentos de inducción. Se utilizaron progesterona y un antagonista, el RU-486, para evaluar si actúan sobre la expresión in vitro de HLA-G, tanto en las CCT como en JEG-3. Las células fueron incubadas en medios con varias concentraciones de progesterona y de RU-486 y en cultivos de control; asimismo, para evaluar la dependencia de la dosis, las células fueron recolectadas luego de 24 horas, mientras que para los estudios en función del tiempo, la recolección celular se realizó después de diferentes períodos de exposición. Como los efectos máximos de la progesterona fueron observados después de 3 a 4 horas, el material celular para técnicas de western blot y reacción en cadena de polimerasa (PCR [polymerase chain reaction]) en tiempo real se recolectó luego de una exposición de 4 horas.

ELISA para proteína HLA-G. Las proteínas HLA-G obtenidas por métodos estándar se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida; luego, se realizó tinción con azul Coomassie y western blot. En las proteínas purificadas se detectaron fracciones de superficie con peso molecular de 38 a 39 kDa, fracciones secretadas con peso molecular de 34 a 35 kDa del HLA-G y moléculas no clásicas clase I. Para la realización de ELISA, las muestras cultivadas y los lisados celulares fueron sometidos al procedimiento estándar. Por último, los valores de HLA-G de las muestras tratadas con progesterona y RU-486 fueron comparados con los controles.

Análisis de western blot. Fueron realizados según el procedimiento estándar, sobre las proteínas totales de cada muestra de lisado celular.

Análisis de PCR en tiempo real. Se obtuvo el ADN por procedimientos habituales y luego se realizó PCR con utilización de cebadores específicos, tanto en sentido anterógrado como inverso. Los resultados se representaron como el número de veces que cambió la expresión del HLA-G (y de la actina beta utilizada como control) luego del tratamiento con progesterona y RU-486, en comparación con los controles.

Análisis estadístico. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se compararon los promedios de los grupos por análisis de variancia, con un nivel de significación estadística de p < 0.05.

Resultados

Efectos de la progesterona sobre la expresión de la proteína HLA-G

Las CCT y las JEG-3 se incubaron con progesterona en concentraciones desde 0 (grupo control) hasta 1 000 ng/ml, con el objetivo de evaluar sus efectos in vitro. Los resultados muestran que, en comparación con los controles, la progesterona exógena incrementó los niveles de proteína HLA-G en las CCT y en las JEG-3 en forma dependiente de la dosis; asimismo, se observó que este incremento fue estadísticamente significativo cuando las células fueron tratadas con dosis de progesterona ≥ 100 ng/ml (F = 8.02, p = 0.0012 para el medio condicionado de JEG-3; F = 5.08, p = 0.0012 para los lisados celulares de JEG-3; F = 4.83, p = 0.0017 para el medio condicionado de CCT y F = 18.3, p = < 0.0001 para los lisados de CCT). Los experimentos de western blot mostraron 2 bandas diferentes: la de menor peso molecular probablemente representaba la forma soluble, y se observó que la densidad de las bandas se incrementaba en forma dependiente de la dosis, de manera similar a lo encontrado en el ELISA. Para poder explorar este efecto en función del tiempo, las células JEG-3 fueron expuestas a medios con 100 ng/ml de progesterona o sin ella durante lapsos de 0 a 48 horas y se advirtió que los efectos máximos sobre la expresión de la proteína HLA-G se lograron luego de 4 a 5 horas de exposición. En los western blot, las células JEG-3 fueron expuestas durante 0 a 4 horas a medios con progesterona en dosis de 1 000 ng/ml o sin ella y se detectó que la reacción más intensa aparecía a las 3 horas luego de la exposición, mientras que luego de 4 horas de incubación, las muestras no tratadas no mostraron cambios.

Efectos de la progesterona en la expresión de ARNm del HLA-G

Para determinar si la progesterona ejerce efectos sobre la expresión de ARNm de HLA-G in vitro se realizó PCR, cuyos resultados mostraron que las dosis de progesterona de 10, 100 y 1 000 ng/ml potenciaron la expresión del ARNm de HLA-G en 2.36-, 10.53- y 17.58- veces, respectivamente, en comparación con los controles (F = 4.54, p = 0.0387). También se investigó el efecto inductor de la progesterona en función del tiempo sobre la expresión del ARNm y los resultados mostraron que se incrementó 17.16 veces luego de una hora con 1 000 ng/ml de progesterona (F = 52.4, p < 0.0001), mientras que no se observaron cambios significativos en las células de control incubadas durante 4 horas (F = 2.61, p = 0.0778).

Efectos de la progesterona sobre la expresión de HLA-G: experimentos con RU-486

Para investigar si los efectos sobre la expresión de HLA-G son ejercidos por unión al receptor de progesterona (RP) se expusieron las células JEG-3 cultivadas a 100 ng/ml de progesterona exógena y, al mismo tiempo, a dosis variables de RU-486 durante 24 horas. Se evaluaron los resultados por ELISA y se encontró que el agregado de RU-486 en dosis de 1 a 1 000 ng/ml inhibió en forma significativa el efecto por regulación en aumento de la progesterona; asimismo, se observó que esta inhibición dependía de la dosis, con un efecto máximo en los 100 ng/ml (F = 2.57, p = 0.0332 para el lisado de células y F = 4.2, p = 0.0153 para el medio de cultivo condicionado). En forma similar, se constató que el RU-486 bloquea el efecto de regulación en amento de la progesterona, tanto con western blot como con PCR (F = 5.60, p = 0.0230), de un modo dependiente de la dosis.

Discusión

Según los autores, en el presente estudio se demostró por primera vez que la progesterona tiene efectos reguladores en aumento sobre la expresión génica del HLA-G en células JEG-3 y CCT in vitro. Los efectos observados dependen de la dosis y son máximos con dosis ≥ 100 ng/ml; asimismo, el estudio en función del tiempo reveló que la producción máxima de HLA-G se observó a las 4 horas, lo que sugiere que la progesterona probablemente ejerce sus efectos a través de la regulación de la transcripción. Los hallazgos in vitro del presente trabajo indican un claro efecto regulatorio de la progesterona sobre la expresión de HLA-G y sugieren que puede cumplir un papel fisiológico importante en la regulación in vivo del HLA-G.

Actualmente, parece claro que una gestación eficaz requiere de una cantidad de factores inmunomoduladores, tanto de la madre como del feto, y aunque la progesterona ha sido propuesta como uno de estos factores desde hace varios años, los mecanismos precisos por los cuales ejerce este efecto aún se investigan.

Los esteroides sexuales ejercen sus efectos a través de receptores intracelulares y se han identificado el RP, las proteínas y el ARNm en el trofoblasto de la placenta humana desde el primer trimestre hasta el final del embarazo. Los autores expresan que el presente trabajo demuestra que el efecto estimulatorio de la progesterona puede ser completamente bloqueado por coincubación con RU-486; asimismo, citan datos previos que indican que el mecanismo de acción del RU-486 se basa en su afinidad de unión al RP, seguida de cambios en la expresión génica que habitualmente se producen entre una y 4 horas. La forma activa del RP se une a una secuencia específica de ADN, denominada elemento de respuesta a la progesterona (PRE [progesterone response element]) y luego se inicia la transcripción de los genes blanco; sin embargo, el promotor del gen HLA-G no presenta esta secuencia PRE, por lo cual el mecanismo molecular responsable del efecto potenciador de la progesterona sobre la expresión del HLA-G aún debe ser investigado.

Conclusiones

Los autores concluyen que, en el presente estudio, se demostró que la expresión del gen de HLA-G está regulada en aumento por la progesterona y señalan que realizarán estudios nuevos dirigidos a evaluar si este efecto está mediado por una secuencia PRE diferente en la región promotora del gen de HLA-G o si son otros los mecanismos involucrados en los efectos inmunomoduladores de la progesterona.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología