Diagnóstico Genético Previo a la Implantación

• AUTOR : Adiga S, Kalthur G, Kumar P, Girisha K
• TITULO ORIGINAL : Preimplantation Diagnosis of Genetic Diseases
• CITA : Journal of Postgraduate Medicine 56(4):317-320, Oct 2010
• MICRO : Se revisan los avances en el diagnóstico genético previo a la implantación de embriones obtenidos por fecundación in vitro, técnica que permite la selección de embriones sanos para su implantación en parejas infértiles o con antecedentes de enfermedades genéticas.

Introducción

El diagnóstico prenatal consiste en la pesquisa de enfermedades genéticas en las primeras etapas de la gestación; por su parte, el diagnóstico genético preimplantatorio (DGP) se refiere a uno aún más temprano, realizado en embriones creados in vitro antes de su implantación en el útero. Esta medida permite que las familias con alto riesgo de presentar enfermedades genéticas puedan tener un hijo libre de enfermedad. El primer paso en este tipo de diagnóstico consistió en la selección sexual de los embriones en el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X hace aproximadamente 20 años. Pese a que su eficacia no ha sido completamente probada, la cantidad de ciclos de DGP crece año a año.

El objetivo de esta revisión fue describir las distintas formas de DGP y sus aplicaciones en la práctica clínica.

Quién se beneficia con el DGP

Existen dos candidatos posibles: por un lado, las parejas en riesgo de transmitir una enfermedad genética, por ejemplo, una enfermedad monogénica o un trastorno cromosómico a su descendencia, debido a un reordenamiento cromosómico equilibrado en uno de los integrantes de la pareja. Pese a que están en condiciones de concebir naturalmente, realizan una fecundación in vitro (FIV) para realizar el DGP, con el fin de seleccionar los embriones sin el defecto genético para la implantación y evitar la técnica invasiva del diagnóstico prenatal y una potencial interrupción del embarazo. Por otro lado, las parejas con trastornos de fertilidad que realizan un procedimiento de FIV tienen la oportunidad de realizar el estudio para la pesquisa de aneuploidías cromosómicas comunes antes de la implantación. Este grupo suele tener mayor riesgo, por ejemplo, de presentar trisomía 21, relacionada con la edad materna, usualmente cuando ésta es mayor de 35 años. En términos generales, se habla de DGP en el primer grupo de pacientes y de pesquisa genética preimplantatoria (PGP) en el segundo.

Trastornos mendelianos (monogénicos)

De esta manera se denominan los trastornos que afectan un único gen, que suelen diagnosticarse por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el caso de las enfermedades autosómicas dominantes, existe un 50% de riesgo de enfermedad en la descendencia, mientras que en las recesivas el riesgo alcanza el 25% si ambos padres son portadores. En las enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X, el riesgo es del 50% para los hijos de sexo masculino. El DGP se aplica eficazmente en diversas enfermedades genéticas y abarca las más comunes, como talasemia beta, fibrosis quística, atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, enfermedad de Huntington, síndrome de Marfan. En el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X, una opción es seleccionar embriones de sexo femenino, que no presentarán la enfermedad, mediante técnicas de hibridación con fluorescencia in situ (FISH) o por PCR. Este enfoque es el ideal en algunos de estos trastornos, en los que el defecto molecular específico es de muy difícil detección, como en el caso de retardo mental o retinitis pigmentosa ligados al cromosoma X. Para la selección de embriones de sexo masculino no afectados se puede recurrir al análisis indirecto del ADN (linkage analysis).

Aneuploidías y trastornos cromosómicos estructurales

Las aneuploidías son una de las causas más frecuentes de embriones alterados. El uso de cinco sondas cromosómicas (X, Y, 13, 18 y 21) permitió detectar alteraciones hasta en el 70% de los embriones obtenidos por FIV, por lo que la pesquisa a este nivel permitiría mejorar las tasas de éxito de la FIV. Además, permitiría detectar las trisomías 21, dado que muchas de las mujeres que son sometidas a una FIV presentan mayor riesgo debido al factor edad. Otros motivos para la búsqueda de aneuploidías son los casos en que se presentan trastornos de la implantación embrionaria o abortos recurrentes sin causa aparente, o en parejas portadoras de una alteración cromosómica estructural balanceada, que generalmente corresponde a translocaciones o inversiones. El estudio se lleva a cabo por sondas específicas de FISH para la región de interés; si la portadora es de sexo femenino, se pueden analizar los cuerpos polares.

Obtención de células a partir de embriones tempranos

Existen tres métodos para llevar a cabo el DGP: el primero y más conocido consiste en el estudio de las células embrionarias individuales (blastómeros) obtenidas en el tercer día de la FIV; se realiza un orificio en la zona pelúcida y se extraen 1 o 2 blastómeros. El segundo enfoque es el estudio de las células trofoectodérmicas, no embrionarias, durante el día 5 del desarrollo. La tercera posibilidad es analizar el material genético presente dentro del primer y segundo cuerpos polares, cuando la alteración genética proviene de la madre.

Biopsia de blastómeros

La biopsia embrionaria consiste en la remoción de 1 o 2 blastómeros en el período de clivaje embrionario; es el procedimiento más usual para el estudio de DGP. Se realiza cuando el embrión posee 6 a 8 células, período en el que ha completado entre 3 y 4 divisiones mitóticas. La biopsia se realiza en el día 3 y la transferencia del embrión genéticamente sano, en el día 4 o 5, momento en el cual ya ha progresado al estadio de blastocisto. La técnica incluye la incubación de los embriones en un medio deficiente de cationes divalentes, para aflojar las uniones intercelulares; se realiza una incisión con láser en la membrana pelúcida de aproximadamente 20 µm y se extraen una o 2 células por aspiración.

Biopsia de blastocisto (trofoectodermo)

La ventaja principal que presenta este método es la gran cantidad de células disponibles para el estudio genético, a diferencia de la anterior, en la que sólo se dispone de 1 o 2 células. Existen dos métodos para la recolección de células de trofoectodermo: en el primero se perfora la zona pelúcida en el estadio blastocisto, en el sitio opuesto al macizo celular interno. Luego de una incubación en cultivo, se produce la protrusión de células trofoectodérmicas a través del orificio, pasibles de ser biopsiadas. La otra forma de realizarlo es mediante un orificio en un embrión temprano, entre el tercer y cuarto día, con el fin de no dañar las células adyacentes; con esta estrategia, el estudio se lleva a cabo en todos los embriones disponibles. La biopsia, con cualquiera de los dos enfoques, se realiza con una pipeta, con la que se aspiran las células, que son separadas del blastocisto con láser. Sin embargo, este tipo de estudios presenta la desventaja de que las células trofoectodérmicas no siempre reflejan las características genéticas reales de las células del macizo celular interno.

Biopsia del cuerpo polar

Los cuerpos polares se consideran material nuclear de descarte luego de la meiosis, pero permiten detectar alteraciones o rearreglos genéticos de origen materno e inferir la calidad del material ovocitario. Se encuentran en el espacio perivitelino y, para acceder a ellos, se debe realizar un orificio en la zona pelúcida. Esta técnica preserva la integridad del embrión, aunque no permite la detección de alteraciones genéticas de origen paterno ni de aquellas que se presentan después de las primeras divisiones embrionarias. Si se analizan los dos cuerpos polares, se pueden detectar alteraciones asociadas con la segunda división meiótica y, en el caso de mutaciones de un único gen, la presencia de entrecruzamiento entre cromosomas homólogos.

Estudio genético de las células biopsiadas

Para alcanzar el objetivo de procesarlas con celeridad y precisión, se usan habitualmente PCR y FISH.

Por medio de la técnica de PCR se amplifica la secuencia de interés del ADN. Dado que los cuerpos polares contienen una sola cadena de ADN haploide y las células biopsiadas contienen un número diploide de ADN, es importante haber identificado la alteración genética previamente, sea en la pareja o en otro hijo; generalmente se emplea para detectar trastornos de genes únicos. Existen otras técnicas derivadas, como la PCR múltiple, la PCR en tiempo real y la PCR cuantitativa fluorescente.

El método FISH emplea una sonda fluorescente marcada que se une a un sitio específico del ADN. Posteriormente, este par es desnaturalizado y las secuencias complementarias se hibridizan. El número de señales fluorescentes resultantes equivalen al número de secuencias objetivo presentes en la muestra. Por ejemplo, si la sonda es específica para el cromosoma 21, en condiciones normales se observarán dos señales; la presencia de tres señales indica una trisomía 21. Las sondas más comunes son X, Y, 13, 18 y 21, y la cantidad de pruebas posibles a realizar en una misma célula están limitadas por el número de fluorocromos. De todos modos, existen técnicas para aumentar la posibilidad de detección de alteraciones complejas, como la mezcla de colores, varias rondas de FISH en la misma célula y la hibridación genómica comparativa. La técnica de FISH permite la detección de aneuploidías de cromosomas autosómicos, sexuales y de rearreglos cromosómicos.

Limitaciones y desafíos de las técnicas de laboratorio

La limitación de este tipo de estudios radica en que tienen una ventana de tiempo muy breve para el análisis y en la escasa cantidad de células a evaluar. Pueden presentar varias dificultades técnicas, como errores en la amplificación, contaminación con ADN externo o dropout alélico (falla en la amplificación de un solo alelo), que puede conducir a resultados falsos positivos o negativos. La probabilidad estimada de transferir un embrión falsamente catalogado como sano por DGP alcanza el 2% para los trastornos recesivos y el 11% para los dominantes.

Cuando se emplea FISH, se pueden presentar inconvenientes, como errores en la hibridación, baja intensidad de señal o señales divididas o fusionadas que pueden provocar resultados falsos. Tampoco permite la detección de mosaicismos, dado que se estudia sólo una célula. El diagnóstico errado por esta técnica alcanza el 7% para aneuploidía y el 6% para mosaicismo.

Consejos para el DGP

Se debe realizar un asesoramiento integral respecto de todas las técnicas involucradas en la FIV, el DGP, los riesgos de enfermedad genética y los costos asociados, además de la comparación de ventajas y desventajas del diagnóstico preimplantatorio y prenatal, las posibilidades de recurrir a la donación de gametas para evitar enfermedades genéticas y las tasas de eficacia y de errores de las técnicas consideradas.

Resultados de las gestaciones

Los datos europeos para 2004 arrojaron 3 358 recolecciones de embriones, de las cuales 1 192 fueron en ciclos con DGP, 2 087 en ciclos con PGP y 79 en ciclos con selección de sexo por causas sociales. Las indicaciones para los estudios genéticos en ciclos con DGP fueron enfermedades monogénicas (n = 520), alteraciones cromosómicas (n = 559) y trastornos ligados al cromosoma X (n = 113). En el caso de las alteraciones cromosómicas, el 76% de los embriones fueron biopsiados, con un 93% de diagnóstico y un 25% de embriones transferidos, mientras que en las enfermedades monogénicas, el 71% de los embriones fueron biopsiados, el 88% ofreció diagnóstico y hubo un 52% de transferencias. El 69.9% de los ciclos resultó en la transferencia de embriones. La tasa de implantación es del 17%, algo menor que la observada en ciclos sin DGP; el seguimiento de los niños nacidos por DGP mostró, a los 2 años, un desarrollo mental y psicomotor similar al de los niños concebidos por técnicas de FIV/ICSI (intracytoplasmic sperm injection). En síntesis, la biopsia embrionaria no parece afectar el curso de la gestación, las características del niño al nacer ni su desarrollo posterior.

Consideraciones éticas

Pese a que muchas parejas desean seleccionar el sexo del feto por causas sociales, esta medida es ilegal en gran parte de los países. Un motivo de selección de fetos por antígeno leucocitario humano es por el antecedente de un hijo previo con enfermedad genética tratable con trasplante de médula ósea; en otras enfermedades de comienzo en el adulto como la enfermedad de Huntington, podría ser una alternativa a explorar.

Conclusiones

El DGP sólo se lleva a cabo en muy pocos centros en el mundo, pero esta práctica presenta un notorio crecimiento. Representa una alternativa válida para aquellas parejas con alto riesgo de transmisión de enfermedades genéticas graves, sobre todo considerando que, en comparación con el diagnóstico prenatal convencional, evita el procedimiento diagnóstico invasivo y una potencial interrupción del embarazo. Sin embargo, las desventajas de este procedimiento son su baja tasa de gestaciones y de nacimientos y su elevado costo.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología