Identifican Diversos Genotipos de Trypanosoma cruzi en la Enfermedad Chagásica Cardíaca Crónica Terminal del Cono Sur

• AUTOR : Burgos JM, Diez M, Schijman AG y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Molecular Identification of Trypanosoma cruzi Discrete Typing Units in End-Stage Chronic Chagas Heart Disease and Reactivation after Heart Transplantation
• CITA : Clinical Infectious Diseases 51(5):485-495, Sep 2010
• MICRO : Se caracterizaron las unidades discretas de tipificación de T. cruzi en pacientes argentinos que fueron sometidos a trasplante cardíaco por enfermedad chagásica cardíaca crónica.

Introducción

Cien años luego de su descubrimiento, la enfermedad de Chagas permanece como una anomalía tropical poco reconocida que afecta a 8 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi en países endémicos y que emerge en regiones donde no es endémica como resultado de los movimientos migratorios. Esta enfermedad tiene un curso clínico variable, en el que la manifestación más común es la enfermedad cardíaca (EC), que afecta aproximadamente un 25% de las personas con enfermedad de Chagas y que representa la principal causa de miocarditis a nivel mundial. El trasplante de corazón es un tratamiento válido para el estadio final de insuficiencia cardíaca, aunque la reactivación de la enfermedad es la complicación principal de la terapia inmunosupresora concomitante. El mismo Carlos Chagas atribuyó a la diversidad de cepas de T. cruzi el pleomorfismo de las manifestaciones de este trastorno. Las poblaciones naturales de estos parásitos tienen una estructura multiclonal compleja con indicios de intercambio genético entre los linajes relacionados en forma lejana. Estos se clasificaron en 6 unidades discretas de tipificación (UDT) I y IIa-IIe principales, que se renombraron recientemente como T. cruzi I a VI y que tienen una distribución geográfica variada y diversas asociaciones epidemiológicas. T. cruzi I es la causa principal de enfermedad de Chagas en el norte de Sudamérica y en América Central, y predomina en los ciclos selváticos a lo largo del continente. En cambio, en el Cono Sur, los involucrados en este trastorno son T. cruzi II, V y VI. La mayoría de los estudios que evaluó la asociación de esta diversidad genética con las manifestaciones clínicas caracterizaron los aislamientos de parásitos provenientes de las muestras de sangre de los pacientes, excluida la detección de poblaciones naturales con tropismo cardíaco.

En este contexto, los autores de este estudio aplicaron estrategias moleculares sensibles para caracterizar las UDT de T. cruzi en los sitios de miocarditis de los corazones extraídos y en las muestras de sangre periférica obtenidas de una cohorte de pacientes con EC que fueron sometidos a trasplante cardíaco, así como de los sujetos que tuvieron reactivación de la enfermedad de Chagas.

Métodos

Fueron internados en forma consecutiva 16 pacientes con EC, con un promedio de 47 años, entre 1998 y 2008, para la realización de un trasplante cardíaco ortotópico. El diagnóstico de infección por T. cruzi se basó en la demostración de reactividad anti-T. cruzi en > 2 de 3 pruebas serológicas estándares. El diagnóstico de EC se basó en los hallazgos clínicos y electrocardiográficos: 11 pacientes tenían EC terminal y 5 presentaban EC y enfermedad cardíaca concomitante de etiología diferente. Todos los pacientes fueron clasificados como clase III y IV de acuerdo con la New York Heart Association. El ecocardiograma reveló dilatación moderada a intensa de las cavidades cardíacas y la fracción de eyección evaluada fue de 21.0 ± 9.8%. La técnica quirúrgica fue biatrial en 8 pacientes y bicava en los restantes.

Se efectuó un análisis comparativo de la prevalencia de UDT particulares entre los pacientes con EC y los que tenían enfermedad de Chagas indeterminada.

Quince corazones extraídos se pesaron y fijaron durante 72 horas en formaldehído fosfatado al 10%; luego, se tomaron secciones transmurales a lo largo de su eje mayor y se embebieron en parafina para su posterior análisis histológico y molecular. Para el diagnóstico de miocarditis se tomó en cuenta el criterio Dallas.

Los pacientes recibieron terapia inmunosupresora triple con inhibidores de la calcineurina (ciclosporina o tacrolimús), esteroides y una tercera droga como azatioprina o micofenolato mofetil. Las dosis se fueron ajustando de acuerdo con los niveles en sangre, la respuesta a la toxicidad, el rechazo o la reactivación de la enfermedad de Chagas. El rechazo agudo de grado > 2 combinado con inestabilidad hemodinámica se trató con metilprednisolona por vía intravenosa.

Se tomaron muestras de sangre antes o durante el trasplante y, luego, junto con especímenes de biopsia endomiocárdica. A las muestras se les practicó el método de Strout, ADN quinetoplasto (ADNq), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR con gen principal empalmado (SL-PCR [spliced-leader]).

También se utilizó western blot para la identificación de pequeños antígenos de superficie de los tripomastigotes (AgST); la reactividad contra antígenos recombinantes I y II permitió distinguir entre los pacientes infectados por T. cruzi I (AgST I) o por T. cruzi II, V y VI (AgST II).

Resultados

Este estudio aplicó un algoritmo basado en el método de PCR que apuntara a tres marcadores genéticos polimórficos para poder identificar las 6 UDT de T. cruzi directamente de las muestras positivas para ADNq-PCR. La amplificación del ADN parasitario y la identificación de la UDT fueron más frecuentes en los especímenes cardíacos extraídos con mayor grado de miocarditis. Los nidos de amastigotes se observaron solamente en 2 muestras cardíacas en secciones con miocarditis grave y difusa. De las 15 muestras cardíacas extraídas, las UDT se identificaron en 8 de ellas (54%). De estas 8 muestras, en 5 se observó infección con UDT II, V o VI (62.5%), mientras que los parásitos DTU I se observaron en 3 casos (37.5%).

Antes o durante el trasplante, los resultados de ADNq-PCR fueron positivos en las muestras de sangre de 5 de los 13 pacientes. En contraste, los resultados de SL-PCR fueron negativos, probablemente por baja parasitemia. Así, la identificación de la UDT se logró mediante el marcador inmunológico AgST. La comparación con la UDT basada en el AgST de un grupo de 27 pacientes con enfermedad Chagas indeterminada reveló mayor frecuencia de reactividad anti-AgST I en los pacientes con EC.

Los 5 pacientes con muestras de sangre positivas para ADNq-PCR persistieron así para esta prueba durante el seguimiento posterior al trasplante. Además, en 7 de los 8 pacientes con resultados negativos para ADNq-PCR, la prueba resultó positiva 7 a 21 días luego del trasplante cardíaco, lo que indicó aumento en la parasitemia. La evaluación con SL-PCR reveló un aumento en la parasitemia 7 a 70 días después del trasplante en 8 pacientes, 6 de los cuales tuvieron reactivación de la enfermedad de Chagas 38 a 98 días después del trasplante. Dado que estos resultados coincidieron con las muestras positivas para ADNq-PCR 28 a 78 días antes de la reactivación, los autores deducen que los resultados positivos sostenidos para SL-PCR sirvieron como marcadores tempranos de la reactivación de la enfermedad.

Luego del trasplante cardíaco, se identificó T. cruzi I en las muestras de sangre de 5 (31%) de 16 individuos evaluados. La proporción de esta UDT fue mayor que en 95 pacientes con enfermedad de Chagas indeterminada, caracterizados por el algoritmo de PCR. Más aún, el genotipo Ia se identificó en las muestras de sangre de 3 pacientes y el Id, en las muestras de un sujeto. El genotipo V se encontró en muestras de sangre posteriores al trasplante de 5 de los 16 sujetos, el genotipo VI en las muestras de un paciente y el genotipo II/VI en muestras de un sujeto. Los análisis de las muestras consecutivas de todos los participantes que fueron sometidos a trasplante cardíaco y se mantuvieron positivos para SL-PCR revelaron la persistencia de la misma UDT en sangre, incluso en los que tuvieran otras UDT en distintos sitios del organismo.

Cinco de los sujetos que tuvieron reactivación de la enfermedad de Chagas presentaron lesiones cutáneas en los miembros inferiores y 1, miocarditis chagásica. Los 6 sujetos fueron tratados con benznidazol y los síntomas remitieron. Sin embargo, uno de esos pacientes tuvo una segunda reactivación diagnosticada como miocarditis, 395 días después del trasplante. Un segundo tratamiento con benznidazol fue eficaz, con parasitemia con resultado negativo luego de 3 años de seguimiento.

La reactivación de la enfermedad de Chagas se asoció con mayor grado de miocarditis en los corazones extraídos y con la técnica quirúrgica: en 5 de los 6 sujetos que tuvieron reactivación se había practicado un trasplante biatrial, mientras que 7 de los 9 sujetos que no tuvieron reactivación fueron sometidos a un trasplante bicavo. No se encontró relación de la reactivación con la edad, el sexo, los episodios de rechazo, la terapia inmunosupresora o el tratamiento con corticoides en pulsos.

Discusión y conclusiones

Los estudios previos de muestras de suero, de aislamientos de cultivos recuperados de muestras de sangre periférica y de muestras clínicas del Cono Sur de América revelaron una predominancia de infección por T. cruzi II, V y VI, lo que reforzó el concepto de que T. cruzi I no causa enfermedad de Chagas en esa región. Este estudio longitudinal reveló un escenario más complejo: 7 pacientes estaban infectados por T. cruzi I, 4 de ellos por T. cruzi I únicamente y 3 coinfectados por otras UDT, que pudieron detectarse en diversas regiones del cuerpo y distintos períodos del seguimiento. Según los investigadores, fue sorprendente la proporción de T. cruzi I entre los pacientes argentinos con EC. La secuenciación del gen principal empalmado permitió confirmar los hallazgos de UDT I y reveló los genotipos Ia y Id. El presente es el primer trabajo que informó genotipos I en muestras clínicas de pacientes con enfermedad de Chagas.

Antes o durante el trasplante cardíaco, las muestras de sangre de la mayoría de los sujetos infectados por T. cruzi I eran negativas para ADNq-PCR y para SL-PCR, indicadoras de la menor parasitemia, que las poblaciones de UDT II, V o VI. Esto podría explicar la baja prevalencia de T. cruzi I en las muestras de sangre obtenidas de los pacientes afectados por enfermedad de Chagas indeterminada y el hecho de que se detectó principalmente en el tejido cardíaco o en muestras de sangre de las personas que recibieron terapia inmunosupresora, en concordancia con los hallazgos recientes en un caso de reactivación de la enfermedad de Chagas a nivel cerebral en un paciente con SIDA.

Se identificó T. cruzi I en pacientes con EC de las provincias de Chaco y Santiago del Estero, T. cruzi I y II, V o VI combinados en las provincias de Salta y Jujuy y T. cruzi II/VI o VI en La Pampa, en tanto que T. cruzi V fue más ubicuo.

La reactivación se asoció con la gravedad de la miocarditis y la persistencia del parásito en los especímenes de los corazones removidos. De hecho, las muestras de tejido cardíaco con nidos detectables (T. cruzi Id y VI) y con mayor proporción de secciones positivas para PCR pertenecieron a los que tuvieron la reactivación de la enfermedad. Por otro lado, se encontró una vinculación con la técnica quirúrgica; la reactivación fue más frecuente en los pacientes en que se practicó un trasplante biatrial. Al parecer, las porciones de aurícula que no se extirpan mediante esta técnica están infectadas y podrían favorecer la invasión por parásitos del corazón implantado.

En los 16 pacientes de este estudio, las lesiones cutáneas aparecieron en 5 y la miocarditis, en 2, proporciones similares a las de otras cohortes. La reactivación se relacionó con resultados positivos tempranos y sostenidos del SL-PCR que acompañaron los aumentos en la parasitemia demostrados por la PCR cuantitativa en tiempo real hecha en muestras de 2 pacientes. Todos los pacientes de esta cohorte que tuvieron reactivación de la enfermedad de Chagas, infectados con cualquier UDT de T. cruzi, respondieron de manera eficaz al tratamiento con benznidazol. Sólo un paciente tuvo un segundo episodio de reactivación: este sujeto estaba infectado con una población monoclonal de T. cruzi VI. Según los expertos, cada vez hay más datos que apoyan la idea de que T. cruzi I y II son linajes emparentados, mientras que T. cruzi V y VI son productos polifiléticos de uno o más eventos de hibridación.

Los autores concluyen que los resultados refuerzan el concepto de que la EC puede ser causada por múltiples clones de parásitos pertenecientes a UDT parientes o híbridas que conforman un escenario natural para los eventos recombinantes interespecíficos y para la evolución de los UDT.

Especialidad: Bibliografía - Infectología