Evalúan el Mecanismo de Inhibición de la Dipeptidil Peptidasa IV por la Sitagliptin

• AUTOR : Davis J, Singh S, Ray A y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Nature Of Action Of Sitagliptin, The Dipeptidyl Peptidase-IV Inhibitor In Diabetic Animals
• CITA : Indian Journal of Pharmacology 42(4):229-233, Ago 2010
• MICRO : La sitagliptina es un inhibidor competitivo, reversible y de uniones fuertes. De manera mecánica, se comporta como un inhibidor rápido in vitro, pero con una larga duración de acción y eficacia in vivo comparable a la vildagliptina, que es un inhibidor lento.

Introducción

La dipeptidil peptidasa tipo IV (DPP-IV) es una serina proteasa que separa dipéptidos, entre ellos el polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) y el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1). La DDP-IV tiene alta afinidad por el GLP-1, ya que lo inactiva y reduce la vida media (< 2 minutos). El GLP-1 es una incretina secretada por las células L del intestino, de modo dependiente de la glucosa. Los inhibidores de la DDP-IV, como sitagliptina, aumentan las concentraciones de GLP-1 activo mediante diversos mecanismos hipoglucemiantes, como la estimulación de la secreción de insulina, la inhibición del glucagón, la promoción de la preservación de las células beta y el retraso en el vaciamiento gástrico, sin efectos adversos, como náuseas y vómitos. La sitagliptina es un inhibidor selectivo de la DPP-IV, potente, activo por vía oral, con excelente biodisponibilidad oral y eficaz en modelos con animales. Este agente fue el primero en ser aprobado a nivel mundial; pero no se informaron en detalle los mecanismos cinéticos de la inhibición de la DPP-IV, a diferencia de otros, como la vildagliptina, que demostró ser un inhibidor reversible y competitivo.

El objetivo de este estudio fue evaluar el mecanismo de inhibición de la DPP-IV, su correlación con la duración de la inhibición in vivo y los efectos hipoglucemiantes y la eficacia de la sitagliptina en un modelo de diabetes tipo 2 en animales.

Materiales y métodos

Se utilizaron para el experimento ratones de 8 a 10 semanas. Los ensayos se realizaron en 10 µl de plasma humano o 10 ng de enzima DDP-IV recombinante humana, con H-glicil-prolil-7-amino-4-metilcumarina (H-Gli-Pro-AMC) como sustrato. Los valores de concentración inhibitoria (CI50) de sitagliptina para la inhibición de la DPP-IV se estimaron con diferentes concentraciones del sustrato H-Gli-Pro-AMC. La naturaleza competitiva se estimó mediante un gráfico donde los valores de CI50 de sitagliptina para diferentes concentraciones de sustrato se colocaron en el eje de Y; mientras que las concentraciones del sustrato en el eje de X. La naturaleza de unión fuerte se estimó por medio del gráfico de los valores de CI50 de sitagliptina determinados con diferentes volúmenes plasmáticos con 40 µM de sustrato en el eje de Y; mientras que los volúmenes plasmáticos crecientes se colocaron en el eje X. Se realizaron estudios de cinética de inhibición de la DPP-IV por sitagliptina mediante la adición de la enzima a la mezcla, la preincubación con el sustrato y diversas concentraciones de sitagliptina y las curvas de progresión de liberación de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) se monitorearon cada 30 segundos por períodos de 15 minutos. La reversibilidad del inhibidor se evaluó por un ensayo de disociación del complejo DPP-IV-sitagliptina. La disociación de este complejo se monitoreó por la hidrólisis del sustrato mediante la medición de la fluorescencia cada 30 segundos durante 60 minutos. La duración de la inhibición de la DPP-IV y la eficacia se examinaron en los ratones a los cuales se les administró una dosis de 10 mg/kg por vía oral de inhibidores de DDP-IV, como sitagliptina, vildagliptina y NVP-DPP728. Se utilizó un grupo control que recibió placebo solamente. A cada grupo se le asignó 9 animales. Se recolectaron muestras de sangre que se centrifugaron y en el plasma se midió la actividad de DPP-IV. Por último, se estimó la duración del efecto hipoglucemiante mediante la administración de los inhibidores de DPP-IV en los ratones en ayunas, seguido de una prueba de tolerancia oral a la glucosa (2 g/kg). Se calculó el área bajo la curva (ABC)0-120 min y se estimó el porcentaje de oscilaciones de la glucemia con diferentes duraciones de los tratamientos en comparación con el placebo.

Los datos se presentaron como media ± error estándar de la media. La significación de la diferencia entre la inhibición de la DPP-IV por sitagliptina y vildagliptina en los ratones se determinó por la prueba de la t de Student. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0.05.

Resultados

Los valores de CI50 de sitagliptina aumentaron linealmente con las concentraciones del sustrato, lo que indica la naturaleza competitiva de la inhibición. La sitagliptina demostró una unión fuerte, ya que los valores de IC50 se incrementaron linealmente con la concentración de la enzima. De este modo, se demostró que la sitagliptina es un inhibidor competitivo y que tiene una unión fuerte con la DPP-IV humana.

Con respecto a la cinética de inhibición, las tasas de hidrólisis de sustrato por la DPP-IV recombinante humana en presencia de crecientes concentraciones de sitagliptina fueron lineales y el estado de equilibrio se estableció instantáneamente, lo cual indica una unión rápida y un modo clásico de inhibición.

La inhibición de DPP-IV por la sitagliptina fue reversible y determinada por la recuperación rápida de la actividad enzimática, que indica una disociación rápida del inhibidor. Por el contrario, la recuperación de la actividad enzimática fue muy lenta con la vildagliptina, lo que indica en este caso una disociación lenta del inhibidor del complejo.

En cuanto a la duración de la inhibición de la DPP-IV in vivo, la administración de sitagliptina por vía oral a 10 mg/kg produjo una inhibición del 90% a los 60 minutos y de más del 70% a las 8 horas. El inhibidor de acción corta, NVP-DPP728, inhibió la actividad de DPP-IV en hasta un 80% durante 60 minutos, con 50% de inhibición a las 2 horas, seguido por la recuperación de la actividad enzimática a las 4 horas. En cambio, el inhibidor de acción prolongada, vildagliptina, logró una inhibición de más del 70% a las 8 horas comparable con la sitagliptina.

La duración del efecto hipoglucemiante se evaluó en los ratones. La administración de sitagliptina y vildagliptina a 10 mg/kg por vía oral a las 0, 4, 8 y 12 horas seguido por la prueba de tolerancia oral a la glucosa demostró un efecto hipoglucemiante del 35% a las 8 horas. Ambos inhibidores mostraron oscilaciones comparables de la glucemia con reducciones significativas en el ABC de la glucosa (-23% contra 20%) hasta las 12 horas.

Discusión

Con la inhibición de la DPP-IV in vivo, deberían aumentar los niveles plasmáticos de GLP-1 activo e insulina después de una comida, con la consiguiente disminución de la glucemia, y esta es la base para su uso como hipoglucemiantes. Hay bastante información acerca de los análisis cinéticos sobre otros inhibidores de la DPP-IV, pero poco sobre la sitagliptina. Por ello, este estudio se propuso caracterizar la cinética de la sitagliptina y correlacionar el perfil in vitro con la duración de la inhibición de la DPP-IV y su eficacia in vivo. De manera ideal, un inhibidor enzimático debe ser competitivo. La identificación de un inhibidor de la DPP-IV selectivo por sobre la DPP 8, 9 y II es importante para evitar las toxicidades multiorgánicas (no selectivos tipo 8 y 9) y la reticulocitopenia en ratas (no selectivo tipo II). La sitagliptina se comportó como un inhibidor competitivo puro, ya que sus valores de CI50 sobre la DPP-IV plasmática humana aumentaron linealmente con las concentraciones del sustrato. También, demostró ser altamente selectivo sobre otras proteasas específicas de la prolina, como la DPP8, DPP9 y DPP II. Los inhibidores que crean uniones fuertes se prefieren desde un punto de vista farmacológico, dado que el agente libre se depura del sistema, mientras que el unido ejerce su función en la circulación por un mayor período. La sitagliptina demostró ser un inhibidor de la DPP-IV de uniones fuertes, dado que los valores de CI50 aumentan linealmente como función de la concentración enzimática (plasma humano). Los parámetros cinéticos que influyen sobre la duración de acción de un inhibidor in vivo son sus constantes de asociación y disociación, y esta información es crucial en la elaboración de un inhibidor de duración corta o larga. La sitagliptina presentó una cinética de unión rápida, demostrada por la respuesta lineal en presencia de diversas concentraciones del inhibidor. La cinética de unión rápida también involucra la disociación rápida del inhibidor del complejo inhibidor-enzima en presencia de un exceso de sustrato. La actividad de la DPP-IV se recuperó rápidamente del complejo sitagliptina-enzima en comparación con la recuperación lenta de la actividad del complejo vildagliptina-DPP-IV en presencia de un exceso de sustrato, lo cual indica una cinética de disociación rápida de la sitagliptina. Sin embargo, a pesar de la cinética rápida de la sitagliptina y la lenta de la vildagliptina in vitro, no hubo un perfil diferente de ambos inhibidores in vivo. En efecto, la sitagliptina inhibió la DPP-IV en igual magnitud que la vildagliptina, con el mismo régimen de dosis (10 mg/kg), ya que en ambos casos fue superior al 70% a las 8 horas, sin diferencias significativas. El predecesor de la vildagliptina, NVP-DPP728, es una molécula menos estable, con una cinética comparable a la vildagliptina in vitro, pero con una duración de acción más corta in vivo.

Los inhibidores de la DPP-IV mejoran la homeostasis de la glucosa por medio del aumento del GLP-1 activo y de la insulina de modo dependiente de la glucosa. La sitagliptina disminuyó la glucemia en forma eficaz hasta 8 horas (aproximadamente, 35%), comparable a lo sucedido con la vildagliptina. Esto sugiere que, independientemente de los mecanismos inhibitorios, tanto la sitagliptina como la vildagliptina inhiben la actividad de DPP-IV de modo similar in vivo, con una eficacia comparable. Las diferencias aparentes en el perfil cinético de inhibición de la DPP-IV no se reflejaron en los niveles plasmáticos de GLP-1 activo y de insulina, ya que ambos produjeron un aumento similar.

Conclusión

Este estudio demostró que la sitagliptina es un inhibidor competitivo, reversible y de uniones fuertes. De manera mecánica, se comporta como un inhibidor rápido in vitro, pero con una larga duración de acción y eficacia in vivo comparable a la vildagliptina, que es un inhibidor lento. Estos hallazgos pueden llevar a la elaboración de una segunda generación de inhibidores de la DPP-IV, con un perfil cinético deseado.

Ref : ENDO, CLMED.

Especialidad: Bibliografía - Clínica Médica - Endocrinología