Acción de los Prostanoides Cardíacos sobre la Apoptosis de los Miocardiocitos en Modelos de Isquemia

• AUTOR : Qiu H, Liu J, Chiamvimonvat N y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Cardiac-Generated Prostanoids Mediate Cardiac Myocyte Apoptosis After Myocardial Ischaemia
• CITA : Cardiovascular Research 95(3):336-345, Ago 2012
• MICRO : La prostaglandina D2 puede inducir la apoptosis de miocitos cardíacos por medio de un mecanismo que es independiente de sus receptores específicos.

Introducción

El infarto agudo de miocardio (IAM) sigue siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La isquemia de duración significativa supera los mecanismos de reparación celular y provoca daño celular miocárdico irreversible o muerte celular. Los eicosanoides comprenden principalmente los prostanoides, los leucotrienos y los ácidos epoxyeicosatrienoides, que son un grupo de mediadores lipídicos derivados del ácido araquidónico (AA), componente de la membrana celular. Se ha demostrado la acumulación de AA libre y metabolitos de los eicosanoides en el miocardio isquémico en modelos con animales y en pacientes con IAM, lo que sugiere la participación de los metabolitos del AA en la patogénesis del daño cardíaco. Sin embargo, el interrogante clave que permanece sin respuesta es si los eicosanoides generados en el corazón son la causa o la consecuencia del daño miocárdico en el IAM.
Los prostanoides, incluidos las prostaglandinas (PG) y los tromboxanos (TX), se generan a partir de AA por las ciclooxigenasas (COX), que existen como isoformas distintas que se identifican como COX-1 y COX-2. La importancia de los prostanoides se reconoce en la reducción de la incidencia y mortalidad del IAM con la administración de dosis bajas de aspirina, un inhibidor de la COX.
Sin embargo, la reciente información que demuestra un aumento en los eventos cardiovasculares asociados con el uso de los inhibidores selectivos de la COX-2 refuerza el hecho de que una gama muy diversa y contrastante de efectos biológicos puede ser atribuible a estos lípidos. Además, hay mucho para aprender acerca del papel de los prostanoides en la patogénesis del IAM.
En el presente estudio, usando un enfoque similar, se probó directamente la hipótesis general de que los eicosanoides generados en el corazón pueden inducir la apoptosis de los miocitos cardíacos y contribuir a la pérdida de células cardíacas después de un IAM. Se cuantificó el perfil de la liberación de prostanoides durante la isquemia cardíaca, y reveló un nuevo mecanismo subyacente de lesión miocárdica mediada por prostanoides utilizando múltiples enfoques.

Métodos

Se utilizó un modelo murino de IAM y perfiles metabólicos para determinar la generación de prostanoides en el plasma y en los tejidos cardíacos después de una isquemia miocárdica. Se utilizaron análisis de Western blot y pruebas de actividad de la COX para determinar el mecanismo subyacente de generación de isquemia inducida por prostanoides. Además, se emplearon cardiomiocitos neonatales cultivados in vitro para probar directamente si los prostanoides generados en el corazón habían participado en la lesión de los miocitos cardíacos. Con el fin de dilucidar las vías involucradas en la apoptosis de los miocitos cardíacos inducida por prostaglandina D2 (PGD-2), se utilizó microscopia con inmunofluorescencia focal para determinar la expresión de los receptores de PGD-2 en los miocitos cardíacos.
El modelo de IAM en ratón fue creado usando el procedimiento previamente descrito. Brevemente, ratones macho de 12 a 16 semanas de edad fueron anestesiados con 80 mg/kg de ketamina y 6 mg/kg de xilacina intraperitoneales. Se utilizó isoflurano para mantener la anestesia durante la cirugía. La profundidad de la anestesia fue monitorizada con pellizcos en el dedo de la pata trasera, y por las frecuencias respiratoria y cardíaca. La arteria coronaria descendente anterior (LAD) fue ligada y mantenida así por 45 min, luego de lo cual fue liberada. El ratón operado en forma simulada sufrió el mismo procedimiento, sin atar la sutura, pero se la dejó alrededor de la LAD por 45 min. Para el tratamiento con aspirina, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente 3 días antes de la cirugía para recibir aspirina disuelta en el agua (50 µg/ml) o agua sola.
Los ratones adultos fueron sacrificados utilizando 80 mg/kg de ketamina y 6 mg/kg de xilacina intraperitoneales, seguido por la rápida exéresis del corazón. A continuación, los corazones fueron perfundidos utilizando el método retrógrado de Langendorff. Después de un período de estabilización de 30 min, los corazones en el grupo de IAM se sometieron a 45 min de isquemia global por el cierre del flujo de la solución de perfusión hacia el corazón, mientras que los corazones en el grupo de tratamiento simulado se perfundieron continuamente durante otros 45 min. A continuación, todos los corazones se enjuagaron brevemente con PBS congelado y los prostanoides tisulares se extrajeron y se determinaron como se describió anteriormente.
El cultivo de miocitos cardíacos primarios se obtuvo a partir de crías de ratón de 1 a 2 días de edad. Los animales fueron anestesiados con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg), después de lo cual los corazones fueron extirpados rápidamente.
Los ecocardiogramas se realizaron en animales conscientes para evaluar la función sistólica mediante modo M y mediciones bidimensionales como se describió anteriormente.
Se consideró que los datos eran estadísticamente significativos cuando se alcanzó un valor de p < 0.05. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.

Resultados

Como un primer paso para evaluar la generación de prostanoides después del IAM, la medición de los niveles en plasma de metabolitos COX demostró un aumento significativo de todos los prostanoides, incluidos PGE-2, PGD-2, PGF-2alfa, 6-ceto-PGF-1alfa (un metabolito estable de PGI-2) y TXB-2 (un metabolito estable de TXA-2) después de 45 min de isquemia miocárdica, de cuatro a siete veces mayor que los animales con operación simulada. Estos niveles disminuyeron gradualmente después de la reperfusión. Con el fin de determinar si los niveles plasmáticos elevados de prostanoides se generaron a partir de tejido cardíaco, los prostanoides tisulares se midieron a partir de corazones de ratón que fueron sometidos a 45 min de isquemia o de operación simulada. El plasma y las muestras de tejidos cardíacos se obtuvieron de los mismos animales. Los niveles tisulares de PGD-2, PGE-2 y 6-ceto-PGF-1alfa también fueron significativamente superiores en los ratones con IAM, en comparación con los ratones con operación simulada, mientras que el nivel de los tejidos de TXB-2 y PGF-2alfa no fueron significativamente diferentes de los animales con operación simulada. Con el fin de excluir la posible interferencia de la células sanguíneas circulantes, la generación de prostanoides del corazón se testeó adicionalmente usando el sistema de perfusión Langendorff en corazones aislados de ratones que fueron perfundidos en el modo mencionado y se sometieron a 45 min de isquemia sin flujo. La determinación de los prostanoides tisulares de corazón de los ratones después de 45 min de isquemia sin flujo mostró niveles significativamente elevados de PGD-2, PGE-2 y 6-ceto-PGF-1alfa tisulares, en comparación con corazones de control (simulacros), un patrón de prostanoides similar al de corazones isquémicos in vivo.
Tanto la proteína COX-1 como la COX-2 fueron detectadas en tejidos cardíacos por Western blot, con niveles más elevados de COX-1 que de COX-2.
Los datos demuestran que los aumentos significativos en los niveles de prostanoides en los tejidos cardíacos, así como en el plasma después de 45 min de isquemia miocárdica, son probablemente el resultado de incrementos en la disponibilidad de AA, sin cambios en la expresión o la actividad de la COX -1 y la COX-2.
El tratamiento con aspirina de los ratones con IAM inhibió significativamente la generación de prostanoides en los tejidos isquémicos del corazón. En línea con la reducción de la producción de prostanoides en el tejido cardíaco, la prueba de TUNEL detecta significativamente menos apoptosis en el tejido cardíaco isquémico en ratones con IAM tratados con aspirina, en comparación con los animales con IAM no tratados. La función cardíaca in vivo se analizó mediante ecocardiografía. En forma congruente, se observó una reducción significativa en la fracción de acortamiento en los ratones con IAM, en comparación con los animales con operación simulada. El pretratamiento con aspirina atenuó significativamente la reducción de la fracción de acortamiento en los ratones con IAM.

Expresión de los receptores de la PGD-2 y PGD-2 regulados por genes en los miocitos cardíacos
A continuación, se investigó el mecanismo de la apoptosis inducida por PGD-2 en los miocitos cardíacos. En primer lugar, se evaluó la expresión de los receptores de PGD-2, DP-1 y DP-2 en los miocitos cardíacos utilizando la tinción con inmunofluorescencia. Tanto los receptores DP-1 como los DP-2 se expresaron en los miocitos cardíacos. DP-1 mostró un patrón de tinción perinuclear, mientras que DP-2 tuvo una expresión presente en la membrana celular. Luego se realizó prueba de reacción en cadena de la polimerasa para identificar los genes de las vías de apoptosis que son objeto de regulación en los miocitos cardíacos por el tratamiento de PGD-2.
El tratamiento de los miocitos cardíacos con PGD-2 regula en aumento en forma significativa el nivel de ARNm del gen proapoptótico Fas ligando (FasL) de una manera dependiente de la dosis. Los análisis de Western blot demostró la regulación en aumento de la proteína FasL en ratones con IAM, en comparación con los ratones control, y el pretratamiento con aspirina resultó en una disminución significativa del nivel de proteína FasL. En cultivos de miocitos cardíacos neonatales, el tratamiento con PGD-2 produjo una regulación en aumento significativa del nivel de proteína FasL en estas células.

Discusión

Papel crítico de los eicosanoides en las enfermedades cardiovasculares
Los eicosanoides son moléculas fundamentales involucradas en diversas cascadas de señalización que regulan las funciones biológicas homeostáticas como mediador de procesos patológicos como la inflamación, el dolor y las enfermedades cardiovasculares. Los fármacos elaborados para estas vías de señalización representan más del 25% de las ventas farmacéuticas anuales en todo el mundo.
A pesar de que la aspirina, un inhibidor prototipo COX-1/COX-2 , ha demostrado ser cardioprotectora al reducir la incidencia y la mortalidad por IAM, una gran cantidad de información clínica reciente indica que los inhibidores selectivos de la COX-2 pueden aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares. Los efectos aparentemente dispares entre los inhibidores de la COX han puesto de relieve la necesidad de una mejor comprensión del papel que la COX y los prostanoides desempeñan en la iniciación y la propagación del IAM.
A pesar de que los eicosanoides son bien conocidos como mediadores clave implicados en la trombogénesis y la iniciación del IAM, el papel exacto que desempeñan en la patogenia de la lesión cardíaca después del IAM no ha sido totalmente dilucidado. Se advierte que desde hace tiempo se ha reconocido que la isquemia cardíaca prolongada conduce a la liberación de AA y sus metabolitos eicosanoides, y esto sucede en paralelo con la aparición de daño cardíaco irreversible. Hasta la fecha, sin embargo, no hay una respuesta clara al interrogante fundamental de si los eicosanoides liberados después de la isquemia cardíaca son la consecuencia o la causa de los daños en las células cardíacas.
La evaluación de los niveles plasmáticos de prostanoides demostró un aumento significativo en todos los metabolitos de la vía de la COX como PGE-2, PGD-2, PGF-2alfa, 6-ceto-PGF-1alfa y TXB-2 después de 45 min de isquemia miocárdica, mientras que la evaluación de los niveles tisulares de prostanoides mostró aumentos significativos en PGE-2, PGD-2 y 6-ceto-PGF-1alfa. Este resultado indica que los altos niveles de PGE-2, PGD-2 y PGI-2 se generaron a partir de tejido cardíaco isquémico, mientras que los niveles plasmáticos elevados de PGF-2 alfa y TXB-2 y fueron generados, con mayor probabilidad, a partir de células sanguíneas, en particular por leucocitos y plaquetas. La expresión de las proteínas COX-1 y COX-2 se detectó en los tejidos cardíacos, con expresión más elevada de la proteína COX-1 que la proteína de la COX-2.
Estos resultados sugieren que el incremento en la generación de prostanoides desde el tejido cardíaco en ratones con IAM fue atribuible principalmente a un incremento en la liberación de AA, y que este aumento fue mediado por COX-1 y no por la enzima COX-2.
Estos datos demostraron que cuando los cultivos de miocitos cardíacos neonatales fueron incubados con una combinación de PGD-2, PGE-2 y PGI-2, que son los prostanoides que se incrementaron en el miocardio isquémico, sufrieron apoptosis. El mismo efecto se observó cuando los miocitos cardíacos fueron tratados con PGD-2 solo, sin PGI-2 o PGE-2 Aunque PGI-2 y PGE-2 se han implicado en la cardioprotección, el origen de sus efectos se ha sugerido como proveniente de un lugar distinto al de los cardiomiocitos y es más probable que participen en la respuesta inflamatoria, que se hace más notoria con la reperfusión prolongada. Estos resultados indican que el efecto neto de los prostanoides cardíacos generados es proapoptótico y que estas sustancias pueden representar uno de los estímulos que llevan a los cardiomiocitos hacia la apoptosis. El tratamiento de ratones con IAM con dosis bajas de aspirina, que inhibe la generación cardíaca de todos los prostanoides, atenúa la apoptosis miocárdica y previene efectivamente la caída de la función cardíaca, lo que proporciona mayor credibilidad a la hipótesis de que los prostanoides generados en el corazón pueden desempeñar una función importante en la lesión cardíaca posterior a un IAM.
La aspirina puede reducir la inflamación en los corazones isquémicos y por lo tanto jugar un papel en la muerte celular miocárdica. Este estudio demostró que el tratamiento con aspirina condujo a la reducción de la apoptosis cardíaca que se produjo dentro de las 6 horas posteriores a la aparición de la isquemia, mientras que la respuesta inflamatoria después del evento isquémico se pone de manifiesto durante 12 a 24 horas después del inicio de la isquemia. Por lo tanto, este estudio sugiere que el tratamiento con aspirina puede prevenir la apoptosis miocárdica, además de sus efectos antiinflamatorios.
Los datos sugieren que el efecto proapoptótico de los prostanoides generados en el corazón se atribuye principalmente a PGD-2. Las actividades biológicas de PGD-2 están mediadas por dos receptores distintos acoplados a proteínas G, el receptor DP-1 y la molécula receptora quimioatrayente homóloga expresada en células Th2 (CRTH2 o DP-2).
Esto sugiere que la PGD-2 puede inducir la apoptosis de miocitos cardíacos por medio de un mecanismo que es independiente de los receptores DP. La investigación adicional sobre los mecanismos implicados en la apoptosis de miocitos cardíacos inducida por PGD-2 proporcionará nuevos conocimientos sobre los acontecimientos que desencadenan la muerte del miocito cardíaco durante el IAM y puede ayudar en el diseño de las intervenciones farmacológicas destinadas a reducir lesiones cardíacas y la aparición posterior de insuficiencia cardíaca después de un IAM.

 
Ref : CARDIO.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología