Aplican un Modelo in Vivo con Embriones de Peces para Identificar Fármacos Modificadores de la Hipertrofia Miocárdica

• AUTOR : Becker J, Robinson T, MacRae C y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : In vivo Natriuretic Peptide Reporter Assay Identifies Chemical Modifiers of Hypertrophic Cardiomyopathy Signalling
• CITA : Cardiovascular Research 93(3):463-470, Mar 2012
• MICRO : Se presenta un modelo experimental <i>in vivo</i> con embriones de pez cebra para la evaluación de la acción de potenciales moléculas modificadoras de las etapas precoces de la insuficiencia cardíaca y la hipertrofia miocárdica.

Introducción

La capacidad de los miocardiocitos para responder al estrés se considera relevante en términos de la preservación de la función miocárdica. A pesar de las terapias disponibles, la prevalencia de la insuficiencia cardíaca continúa en aumento. Los fármacos resultan eficaces en las etapas tardías del síndrome de insuficiencia cardíaca, pero se reconocen dificultades para la creación de productos que puedan intervenir en las fases previas y, por lo tanto, prevenir la enfermedad. Incluso en las etapas iniciales, la insuficiencia cardíaca se define como un proceso multisistémico, por lo cual el planteo en protocolos in vitro resulta de gran complejidad. En este contexto, se destaca que los estadios larvarios del pez cebra representan un modelo que se considera adecuado para la evaluación de moléculas pequeñas in vivo. En los seres humanos, tanto en la hipertrofia miocárdica como en la insuficiencia cardíaca se verifica regulación por aumento del eje de los péptidos natriuréticos, cuyos ligandos principales son el péptido natriurético auricular y el péptido natriurético tipo B. La inducción de los genes respectivos se define como un biomarcador de estrés de los miocardiocitos en los modelos de enfermedad cardiovascular en los mamíferos. Se advierte que estos genes se expresan en forma acentuada durante el desarrollo cardíaco embrionario; en el pez cebra, se describe una expresión dinámica de estos genes en el marco de la cardiogénesis. Se ha informado que la expresión de los péptidos natriuréticos se incrementa en el corazón embrionario de estos animales en respuesta a estímulos patológicos; este modelo de respuesta difiere de la inducción observada para estos genes en el contexto del desarrollo.

Con el fin de crear un modelo experimental adaptable a la pesquisa de fármacos modificadores de la insuficiencia cardíaca se describen los resultados de una línea indicadora transgénica en peces cebra para modelar la repuesta patológica de los péptidos natriuréticos.

Métodos

Por medio de técnicas específicas se procedió a la clonación de constructos de ADN complementario de los genes nppa y nppb, con producción de un plásmido. Asimismo, en embriones de peces cebra en estadio unicelular se procedió a la inoculación de morfolino para la realización posterior de la amplificación de ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa. Los constructos indicadores de péptidos natriuréticos se elaboraron en función de los promotores de los genes nppa y nppb, marcados para pruebas de inmunohistoquímica o ensayos con luciferasa. Los embriones fueron incubados en medios específicos, con exposición posterior a isoproterenol, carvedilol, milrinona y fármacos experimentales.

Resultados

Se reconoce una acentuada expresión de ambos péptidos natriuréticos durante la cardiogénesis de los peces cebra, si bien la respuesta patológica de estos biomarcadores durante la cardiogénesis no ha sido definida. En este ensayo, se llevaron a cabo análisis por montaje total in situ de la expresión de los genes nppa y nppb en embriones intactos, con identificación de un incremento cualitativo de la expresión en respuesta a 2 factores estresantes de la fisiología de los miocardiocitos (empalme anormal de la troponina T y mutación homocigótica del gen grl). Tanto en los embriones control como en los ejemplares con mutaciones se observó que los estímulos de hipertrofia del miocardio no modificaron la inducción embrionaria de los péptidos natriuréticos. Sin embargo, se verificó una alteración relevante de la regulación del control posterior de la expresión de estas moléculas.

Se destaca que en los modelos con constructores indicadores transgénicos fluorescentes no se identificaron áreas de expresión de estos genes marcados en regiones no cardíacas de los embriones, incluso a las 72 horas posteriores a la fertilización. Se enfatiza en que los indicadores fluorescentes constituyen un modelo adecuado para definir los patrones de expresión de los péptidos natriuréticos durante el desarrollo embrionario. De todos modos, los autores señalan que las determinaciones semicuantitativas de la fluorescencia en estos embriones de pez cebra no aseguran la rigurosidad técnica suficiente. Por lo tanto, se complementó la evaluación por medio de la marcación con luciferasa de los promotores validados para los genes nppa y nppb. En los modelos de exposición a fármacos se comprobó que estas líneas transgénicas permiten la valoración de múltiples aspectos de la expresión del gen nppb, por lo cual podrían resultar de utilidad en el estudio de las vías relacionadas con la hipertrofia y la insuficiencia cardíaca. En este contexto, el tricostatín A (un inhibidor de la desacetilasa de las histonas [HDAC]) y la molécula U0126 (un inhibidor de las proteinquinasas activadas por mitógenos [MEK] tipo 1 y 2) fueron antagonistas potentes de la inducción de los indicadores patológicos de hipertrofia de los miocardiocitos.

Discusión y conclusiones

Los expertos enfatizan en que las vías genéticas que controlan la inducción patológica de los péptidos natriuréticos cardíacos se encuentran preservadas durante la cardiogénesis en los peces cebra. Asimismo, estas vías son diferentes de aquellas que regulan la inducción de estos genes en el desarrollo embrionario. Por medio de las líneas indicadoras marcadas con técnicas de fluorescencia o luciferasa se propone un protocolo veloz y confiable para la pesquisa de fármacos modificadores de la expresión de los péptidos natriuréticos cardíacos. Estos péptidos se definen como biomarcadores de la disfunción y la hipertrofia del miocardio. Tanto el tricostatín A como el U0126 se consideraron inhibidores acentuados de la hipertrofia de los miocardiocitos.

La elaboración de modelos para el análisis de afecciones complejas como la insuficiencia cardíaca resulta difícil en protocolos in vitro; en este sentido, las líneas de miocardiocitos disponibles comparten propiedades de otras células musculares o son derivadas de neoplasias cardíacas. El embrión intacto del pez cebra presenta un corazón funcional, endotelio intacto y circulación activa, por lo cual se postula como un mejor modelo para la complejidad propia de la insuficiencia cardíaca. La incorporación de un ensayo cuantitativo con luciferasa facilita la evaluación rápida de una red de genes que se expresan en el marco de la hipertrofia miocárdica y la insuficiencia cardíaca en múltiples especies de vertebrados. En el presente estudio se describieron las primeras pruebas experimentales en modelos in vivo acerca de la respuesta a la exposición a inhibidores de la HDAC o de la MEK-1/2 en miocardiocitos con mutaciones génicas asociadas con hipertrofia cardíaca. En la actualidad se dispone de escasos recursos farmacológicos para el tratamiento de la miocardiopatía hipertrófica, sin capacidad para inducir la regresión de la hipertrofia ventricular establecida.

De este modo, este modelo permite la identificación in vivo de elementos modificadores genéticos y bioquímicos a nivel de la vía de señalización de los péptidos natriuréticos cardíacos. Con este protocolo, se reconoció que tanto el tricostatín A como la molécula U0126 podrían modificar de forma favorable la respuesta patológica de los genes asociados con la miocardiopatía hipertrófica. La disponibilidad de esta línea indicadora sería útil para la evaluación in vivo de potenciales fármacos moduladores de las vías metabólicas relacionadas con la insuficiencia cardíaca o la hipertrofia del miocardio.

Ref : CARDIO.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología