Demuestran Anomalías en la Fragmentación Proteica en Muestras de Tejido Endometrial Ectópico

• AUTOR : Chehna-Patel N, Warty N, Khole V y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Proteolytic Tailoring of the Heat Shock Protein 70 and its Implications in the Pathogenesis of Endometriosis
• CITA : Fertility and Sterility 95(5):1560-1567, Abr 2011
• MICRO : Se describe un incremento de la actividad proteolítica en el tejido endometrial ectópico, en la cual la fragmentación de la proteína HSP70 y su consecuente deterioro funcional serían un componente de la acentuación del fenotipo patológico descrito en estas células endometriales.

Introducción

La endometriosis se define como el crecimiento de estroma o glándulas endometriales en tejidos extrauterinos. La repercusión clínica de la enfermedad incluye dismenorrea, dolor pelviano crónico e infertilidad. La histogénesis de la endometriosis se atribuye a la implantación de tejido de origen menstrual en la cavidad abdominal por reflujo a través de la trompa de Falopio.

En estudios previos se ha reconocido que algunas proteínas se expresan en forma excesiva en el endometrio extrauterino ectópico en comparación con el tejido endometrial ortotópico. Una de estas moléculas es un fragmento de la proteína de shock térmico 70 (HSP70); en esta familia se incluyen 12 variantes, entre las que se encuentra la proteína HSPA8. Estas moléculas actúan como chaperonas al modular los procesos de plegado y translocación de otras proteínas. La presencia de fragmentos de la HSP70 en el tejido endometrial intrauterino ya había sido mencionada en ensayos previos. Sin embargo, la presencia de fragmentos más pequeños de esta familia de proteínas ha sido observada en diversos tejidos somáticos y tumorales. La existencia de un fragmento de 20 kD de la proteína HSP70 es un descubrimiento nuevo en este grupo de moléculas y su expresión en el endometrio ectópico ha motivado la investigación acerca de su origen en el procesamiento de la proteína original.

En este contexto, se presentan los resultados de un análisis de este fragmento proteico en su potencial papel de transcripto alternativo o bien como resultados de eventos posteriores a la trascripción.

Materiales y métodos

Participaron del estudio mujeres de 22 a 35 años, sin antecedentes de enfermedad pelviana inflamatoria, neoplasias, infecciones, trastornos hemorrágicos o utilización de esteroides o agonistas de la hormona liberadora de gonadotrofinas. Se obtuvieron biopsias pareadas de tejido endometrial ortotópico y ectópico de 18 pacientes sometidas a laparoscopia diagnóstica o terapéutica como consecuencia de endometriosis. Del mismo modo, se reunieron muestras de 20 mujeres (grupo control) sin signos visuales de endometriosis en una evaluación por laparoscopia. Las biopsias fueron fechadas y se aseguró la representación de especímenes de ambas fases del ciclo menstrual para evitar sesgos en los resultados finales. Las muestras tisulares fueron procesadas para obtención de extractos proteicos y recolección de ARN. Mediante una herramienta específica para la caracterización proteica se determinó la secuencia de la HSP70, que se expuso a subtilisina parcialmente purificada para definir su capacidad de lisis. La localización in situ de las proteínas en las distintas muestras de tejido endometrial se complementó con anticuerpos dirigidos contra la proteína HSP70 y el factor nuclear kappaB (NF-kappaB).

Resultados

De acuerdo con lo señalado por los investigadores, la exposición a los anticuerpos contra la HSP70 en un modelo de inmunotransferencia permitió reconocer la presencia de dobletes del fragmento de 20 kD en 8 de los 10 lisados obtenidos de tejido ectópico. En la mitad de esas muestras se observó la presencia de una banda adicional de 35 kD. Como contrapartida, no se identificó otra forma molecular diferente de la proteína de 70 kD en ninguna de las muestras obtenidas de tejido ortotópico de pacientes con endometriosis o del grupo control. En consecuencia, la variante de 20 kD de la proteína HSP70 sólo se detectó en el endometrio ectópico.

Con la meta de definir si estas variantes se originaron como consecuencia de cambios en la transcripción o bien después de esta etapa, se aplicó un modelo de reacción en cadena de la polimerasa con el uso de diferentes cebadores para la región completa de la proteína HSPA8. En esta experiencia no fue posible obtener proteínas truncadas de 20 kD o 35 kD para los distintos pares de amplicones evaluados. Del mismo modo, por medio de un ensayo de estimación de la actividad total de proteasas, se observaron registros significativamente mayores en los lisados de tejido endometrial ectópico en comparación con las muestras del grupo control. Asimismo, se describió una tendencia a mayor actividad proteolítica en el tejido ectópico en comparación con las muestras de endometrio intrauterino. Como corolario, los autores postulan que la acción proteolítica sobre la proteína HSP70 en las biopsias de tejido ectópico no fue atribuible a mayor nivel general de proteasas, sino a la activación de enzimas específicas. Sobre la base de estos resultados, se completó una prueba de zimografía en la que se reconoció la expresión de una proteasa de alto peso molecular junto con actividad significativamente elevada en la banda de las proteasas de 66 kD. Por lo tanto, se señala que el tejido endometrial ectópico se caracterizó por diferencias tanto en la capacidad proteolítica como en la expresión de las distintas proteasas.

Se advirtió, además, la ubicación citoplasmática y nuclear de la proteína HSP70 en las muestras de control y de endometrio ortotópico, a nivel de las células glandulares y del estroma. En cambio, en las biopsias de endometrio ectópico, esta molécula se localizó principalmente en el compartimiento citoplasmático. Por otra parte, el NF-kappaB se ubicó en el citosol de las células de las muestras de control y de endometrio ortotópico, con predominio de las células glandulares y, en menor medida, en aquellas ubicadas en el estroma. Por el contrario, en las biopsias de tejido endometrial ectópico, esta molécula se localizó en el núcleo celular, si bien la expresión total del NF-kappaB no difirió entre los tres grupos de muestras. La localización nuclear de esta molécula permitió presumir su participación como factor activo de transcripción; en consecuencia, los autores optaron por determinar la expresión de la interleuquina 6 (IL-6), que constituye uno de los objetivos de esta vía de señalización. Se demostró así, una mayor expresión de dímeros de IL-6 en el tejido ectópico, en comparación con los niveles observados en las muestras de control y de tejido endometrial ortotópico.

Discusión

Debido a sus múltiples funciones, la familia de las HSP70 ha provocado interés en la investigación sobre la biología de los procesos mórbidos. De todos modos, se reconoce que los resultados relacionados con los niveles de estas moléculas en las pacientes con endometriosis son motivo de debate. En este análisis, los autores verificaron mayor expresión de un fragmento de 20 kD de la proteína HSPA8 de la familia HSP70 en el tejido ectópico de estas mujeres. Mediante pruebas de inmunotransferencia se confirmaron las observaciones previas, según las cuales estos fragmentos sólo se expresan en muestras de tejido endometrial ectópico. La aplicación posterior de métodos de reacción en cadena de la polimerasa con múltiples pares de cebadores no permitió reconocer diferencias en el tamaño de los transcriptos de la proteína HSPA8 entre las muestras de control y las correspondientes a tejido endometrial intrauterino o ectópico. Por lo tanto, se estimó que los fragmentos de 20 kD se originaron de la HSP70 debido a las modificaciones posteriores a la transcripción, como ocurre con la degradación por proteólisis. Aunque no se demostró mayor actividad proteolítica en el tejido ectópico, se comprobó la expresión aberrante de ciertas proteasas en estas muestras. Del mismo modo, el tejido ectópico de las mujeres con endometriosis se caracterizó por la localización conjunta y significativa de la HSP70 y de la proteasa SKI-1, perteneciente a la familia de proteínas similares a la subtilisina. La existencia de la localización diferencial, así como la menor expresión o reducción de la actividad proteolítica, podrían explicar la ausencia de fragmentación de la proteína HSP70 en las muestras de control y en las biopsias de tejido endometrial ortotópico.

Así, los investigadores postularon que la falta de disponibilidad de la proteína HSP70 completa podría facilitar la translocación irrestricta del NF-kappaB en el núcleo y la subsecuente transcripción de genes. El epitelio glandular del tejido ectópico no presentó localización nuclear de esta molécula; en este contexto, los investigadores señalan que numerosos objetivos de la actividad del NF-kappaB (citoquinas proinflamatorias, metaloproteinasas de la matriz, factores angiogénicos, entre otros) forman parte de la fisiopatogenia de la endometriosis. La ausencia de regulación por parte de la proteína HSP70 de aquellos factores de trascripción como el NF-kappaB podría producir la expresión constitutiva de ciertos genes, con perpetuación de la inflamación crónica que caracteriza las lesiones por endometriosis.

Como conclusión, los autores aseguran que se ha demostrado un incremento de la actividad proteolítica en el tejido endometrial ectópico, en la cual la fragmentación de la proteína HSP70 y su consecuente deterioro funcional serían un componente de la acentuación del fenotipo patológico descrito en estas células endometriales.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología