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Detectan Cepas de Klebsiella pneumoniae Productoras de Beta Lactamasas Resistentes a Cefalosporinas
- AUTOR : Muratani T, Kobayashi T, Matsumoto T
- TITULO ORIGINAL : Emergence and Prevalence of ß-Lactamase-Poducing Klebsiella Ppeumoniae Resistant to Cephems in Japan
- CITA : International Journal of Antimicrobial Agents 27(6):491-499, Jun 2006
- MICRO : Los mecanismos de resistencia de 44 de 46 aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes a cefalosporinas y cefamicinas detectados en Japón se debieron a la producción de beta lactamasas de espectro extendido o beta lactamasas del tipo AmpC codificadas por plásmidos o metalobetalactamasas del tipo IMP-1.
Introducción
La Klebsiella pneumoniae presenta sensibilidad intrínseca a las cefalosporinas de espectro extendido y a las cefamicinas, dado que no contiene la beta lactamasa cromosómica del tipo AmpC. Sin embargo, la emergencia de beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) mediadas por plásmidos produjo especies con resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro. La mayoría de las BLEE son capaces de hidrolizar las cefalosporinas de espectro extendido, pero no las cefamicinas. Las cefamicinas son hidrolizadas por las beta lactamasas del tipo AmpC y las metalobetalactamasas. Estas últimas, codificadas por plásmidos como IMP-1, son capaces de hidrolizar las cefalosporinas y las cefamicinas. En Japón, se informó la aparición de enterobacterias productoras de BLEE, de beta lactamasas del tipo AmpC codificadas por plásmidos y metalobetalactamasas en 1995, 1993 y 1994, respectivamente. Estos patógenos mostraron resistencia tanto a cefalosporinas como cefamicinas. Los objetivos de este estudio consistieron en determinar la prevalencia y los genotipos de las beta lactamasas en los aislamientos clínicos de K. pneumoniae resistente a cefalosporinas y cefamicinas en Japón.
Materiales y métodos
Se seleccionaron 46 cepas de K. pneumoniae resistentes a cefalosporinas con concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) > 8 µg/ml para cefpodoxima y cefmetazol, obtenidas de diferentes pacientes provenientes de 8 hospitales de Northern Kyushu Island, Japón, entre los años 2000 y 2002. La cepa de Escherichia coli ML4905, resistente a rifampicina, se utilizó como receptor para los experimentos de conjugación. Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana para K. pneumoniae y E. coli se realizaron por el método de dilución en agar seriado. Se utilizó reacción en cadena de polimerasa (PCR [polymerase chain reaction]) para la detección de los genes de beta lactamasas de clase A, B y C y también se determinaron las secuencias de ADN de los genes estructurales de cada beta lactamasa y se empleó la técnica de enfoque isoeléctrico para su detección. Para la prueba de inducción de beta lactamasas se empleó el método modificado de antagonismo en disco. Se realizó la caracterización molecular de los 46 aislamientos con el análisis de fragmentos de restricción del ADN cromosómico con electroforesis en gel de campo pulsátil (PFGE [pulse-field gel electrophoresis]) con la endonucleasa XbaI. Se realizó la conjugación bacteriana con la cepa E. coli ML4905 resistente a rifampicina para la transferencia de genes de beta lactamasas.
Resultados
De los 46 aislamientos, 2 fueron productores de beta lactamasa CMY-2 y 41, DHA-1 (estos últimos provinieron de 5 hospitales). Cuarenta de las 41 cepas productoras de beta lactamasas DHA-1 generaron simultáneamente BLEE SHV-12 y el aislamiento restante, SHV-27. Además, una de las cepas productoras de DHA-1 y SHV-12 también originó la metalobetalactamasa del tipo IMP-1, producida también por otro aislamiento.
Las CIM de ceftazidima para todas las cepas, excepto Rkp850, fueron ≥ 16 µg/ml; el agregado de ácido clavulánico la redujo contra algunos aislamientos. Por su parte, la CIM de cefpiroma contra Rkp1717 fue muy alta. Las CIM de ceftazidima contra Rkp2038 y Rkp 1357 se redujeron más de 8 y 256 veces, respectivamente, con el inhibidor de metalobetactamasas, MPA. El análisis por PFGE demostró que 28 de 29 aislamientos provenientes del hospital H mostraron patrones iguales o similares (tipo H), mientras que los 10 aislamientos provenientes del hospital Y más el único aislamiento del hospital A exhibieron el mismo patrón (tipo Y). Las otras cepas mostraron un patrón único por PFGE. De acuerdo con la PCR y el análisis de secuenciamiento del ADN, 28 cepas con patrón por PFGE tipo H, las 10 cepas con patrón por PFGE tipo Y más la cepa Rkp1676 con patrón único contuvieron beta lactamasas DHA-1, SHV-12 y TEM-1. El secuenciamiento de ADN de blaDHA-1 fue idéntico a la secuencia informada blaDHA-1. Si bien las CIM de ceftazidima en combinación con ácido clavulánico, comparadas con ceftazidima sola, contra las 28 cepas con patrón por PFGE tipo H y Rkp2013 no se redujeron, a pesar de la producción de BLEE tipo SHV-12, las CIM de ceftazidima más tazobactam disminuyeron en más de 16 veces. La inducción de beta lactamasas se demostró por la prueba de antagonismo en disco. Se detectó ampR, corriente arriba de blaDHA-1,para los 29 aislamientos con beta lactamasas inducibles y para Rkp625. La secuencia de aminoácidos de ampR difirió sólo en un aminoácido de la secuencia informada y contuvo Glu en lugar de Gli en la posición 90. Respecto de la cepa Rkp625, la prueba de inducción de beta lactamasas no pudo evaluarse debido a la ausencia de una zona inhibitoria con cefotaxima y moxalactam. Por ende, la beta lactamasa DHA-1 de Rkp625 es producida en forma constitucional. Sin embargo, las secuencias de ADN de blaDHA-1, su gen promotor y ampR fueron 100% idénticas a las de las cepas con patrón por PFGE tipo H. Por el contrario, la CIM de las cefalosporinas contra las 9 cepas con patrón por PFGE tipo Y, con la excepción de Rkp2013 y Rkp2038, se redujo por el agregado de ácido clavulánico y no se detectaron beta lactamasas inducibles en estos 9 aislamientos. Si bien las secuencias de ADN de blaDHA-1 y su gen promotor fueron 100% idénticas a las cepas con patrón por PFGE tipo H, ampR no se amplificó por PCR. Las cepas Rkp1357 (patrón único por PFGE) y Rkp2038 (patrón por PFGE tipo Y) con CIM elevadas para ceftazidima que se redujeron por el agregado de MPA, tuvieron blaIMP-1. Además, la cepa Rkp2038 también portó blaDHA-1, ampR, blaSHV-12 y blaTEM-1, de modo similar a otras cepas con patrón por PFGE tipo Y. Se detectó CMY-2 para Rkp537 y Rkp859; de modo que la beta lactamasa se produjo en forma constitutiva. Las CIM de todas las cefalosporinas, excepto cefpiroma, contra Rkp524 fueron altas. Se estima que Rkp524 fue productor de beta lactamasa de clase C debido a que la cepa tuvo un elevado punto isoeléctrico (pI > 9) y la CIM de ceftazidima en combinación con ácido clavulánico, tazobactam y MPA comparado con ceftazidima sola permaneció sin cambios. No se detectaron por PCR CYM-2 y DHA-1, así como MIR-1/ACT-1 y ACC-1. Tampoco se detectaron BLEE para Rkp850, que tuvo TEM-1 y SHV-1. Las pruebas de conjugación demostraron que 9 de 12 cepas con patrón por PFGE tipo H resultaron en transconjugados productores de beta lactamasas que se seleccionaron en placas con 4 µg/ml de cefpodoxima o cefmetazol y 200 µ/ml de rifampicina. Se obtuvieron 3 transconjugados diferentes de Rkp2004, que es una cepa con patrón por PFGE tipo H. Uno tuvo blaDHA-1 sola, otro blaDHA-1 y blaSHV-12 y el tercero blaDHA-1, blaSHV-12 y blaTEM-1. Las CIM de cefmetazol contra estos transconjugados fueron 32 a 64 veces más altas que para la cepa de E. coli ML4905. La prueba de inducción de beta lactamasas para los transconjugados que recibieron sólo beta lactamasa DHA-1 de la cepa Rkp2004 fue positiva, pero no resultó así para los otros transconjugados que recibieron beta lactamasas DHA-1 y SHV-12 o TEM-1. Si bien los transconjugados de las cepas con patrón por PFGE tipo Y o de Rkp1676 tuvieron blaDHA-1, las CIM de cefmetazol y cefoxitina contra estos transconjugados fueron similares a las de la cepa de E. coli ML4905. En la cepa Rkp1033 no se realizaron los experimentos de conjugación debido a la resistencia intrínseca a rifampicina. Los genes blaIMP-1 de Rkp2038 y Rkp1357 pudieron transferirse por separado. El gen blaCMY-2 de Rkp537 y Rkp859 también fue transferible. No se detectaron transconjugados a partir de Rkp850, Rkp625 o Rkp524.
Discusión y conclusión
Según los autores, en este estudio se aislaron 2 cepas productoras de beta lactamasas CMY-2 de diferentes hospitales y se encontró que estos clones difirieron entre sí por el análisis por PFGE. Cuarenta y una cepas productoras de beta lactamasas DHA-1 se aislaron de 5 instituciones. Según los investigadores, este es el primer informe del aislamiento de K. pneumoniae productora de DHA-1 en Japón. Respecto del hospital H, 28 pacientes presentaron infección por K. pneumoniae productora de beta lactamasas DHA-1 y SHV-12; aislamientos que tuvieron el mismo o similares patrones por PFGE. En el centro médico Y, 10 pacientes presentaron infección por K. pneumoniae productora de beta lactamasas DHA-1 y SHV-12, aislamientos con el mismo patrón por PFGE. Por ende, en estos 2 centros se detectaron infecciones nosocomiales debidas a cepas de K. pneumoniae productoras de beta lactamasas DHA-1 y SHV-12. Además, este ensayo fue el primero que informó en Japón la presencia de otras beta lactamasas del tipo AmpC codificadas por plásmidos. Los resultados sugieren que la cepa Rkp2038 del hospital Y adquirió un plásmido con un gen IMP-1. Previamente se comunicó que DHA-1 es una beta lactamasa inducible en la K. pneumoniae. En este estudio, 31 de los 41 aislamientos con DHA-1 (28 con patrón por PFGE tipo H, Rkp2013, Rkp2038 y Rkp625) tuvieron ampR corriente arriba del gen de la beta lactamasa DHA-1 y ampR no se detectó por PCR en los restantes 10 aislamientos (9 con patrón por PFGE denominado tipo Y más Rkp1676). La CIM de ceftazidima contra las cepas productoras de beta lactamasa DHA-1 sin ampR se redujo en combinación con ácido clavulánico pero no disminuyó en el caso de aislamientos productores de DHA-1 con ampR. La actividad inducible de ácido clavulánico contra la beta lactamasa DHA-1 contrarrestó el efecto inhibitorio del ácido clavulánico contra la beta lactamasa SHV-12. El tazobactam, que no tiene una actividad inducible contra AmpC y presentó actividad inhibitoria contra las beta lactamasas SHV-12 y DHA-1, redujo la CIM de ceftazidima contra todas las cepas productoras de beta lactamasas DHA-1 y SHV-12.
En conclusión, los mecanismos de resistencia de 44 de 46 aislamientos de K. pneumoniae resistentes a cefalosporinas y cefamicinas se debieron a la producción de BLEE o de beta lactamasas del tipo AmpC codificadas por plásmidos o metalobetalactamasas del tipo IMP-1. El mecanismo de los otros 2 aislamientos no fue identificado. Las beta lactamasas de clase A, B y C con actividad de amplio espectro proveyeron los mecanismos de resistencia a las cefalosporinas y cefamicinas en los aislamientos de K. pneumoniae. Estos resultados demuestran que es necesario minimizar la prevalencia de estas cepas resistentes debido a que se produciría un problema grave si estos microorganismos productores de beta lactamasas de amplio espectro aumentan en la práctica clínica.
Especialidad: Bibliografía - Infectología