Efectos de la Capsaicina sobre Células de Colangiocarcinoma Humano

• TITULO : Efectos de la Capsaicina sobre Células de Colangiocarcinoma Humano
• AUTOR : Wutka A, Palagani V, Plentz R y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Capsaicin Treatment Attenuates Cholangiocarcinoma Carcinogenesis
• CITA : PLos One 9(4), Abr 2014
• MICRO : El tratamiento de células de colangiocarcinoma humano con capsaicina inhibe la proliferación, la migración, la invasión y la capacidad de formación de colonias; además, la apoptosis se incrementa y se modifica la transición epitelial-mesenquimática. Los resultados en conjunto demuestran que la capsaicina afecta la vía de señalización de Hedgehog.

Introducción

La frecuencia del colangiocarcinoma (CC) está en aumento en todo el mundo; el CC representa el segundo tumor primario hepatobiliar más frecuente. En la mayoría de los casos, el CC es un adenocarcinoma que surge en las células epiteliales del sistema biliar intrahepático y extrahepático. La colangitis esclerosante primaria, la cirrosis, la hepatitis crónica por virus B y C de la hepatitis, la diabetes, la obesidad, el tabaquismo, el consumo de alcohol y la exposición a ciertas toxinas son algunos de los factores conocidos de riesgo de CC.

El CC, por lo general, se diagnostica en estadios avanzados, de modo que las posibilidades de cirugía curativa son escasas. Las únicas opciones terapéuticas, para los pacientes con CC inoperable, incluyen la terapia fotodinámica, la quimioterapia sistémica y la radioterapia.

Diversos estudios demostraron que los CC se asocian con ciertas mutaciones genéticas, por ejemplo en los genes KRAS, BRAF, p53, SMAD y p16INK4a. La combinación de gemcitabina más cisplatino representa el esquema antineoplásico de primera línea para los CC; sin embargo, los esquemas convencionales de quimioterapia se asocian con eficacia limitada.

Ciertos productos botánicos y algunos suplementos alimentarios se caracterizan por sus propiedades antineoplásicas. La capsaicina es un derivado del ácido homovanílico y la principal sustancia picante en los chiles rojos. La capsaicina se asocia con efectos analgésicos y antiinflamatorios; en diversos estudios, la capsaicina ejerció, también, efectos antiproliferativos en diferentes células de tumores gastrointestinales.

Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos de la capsaicina en las vías de señalización involucradas en la carcinogénesis de los CC no se conocen. La vía de señalización de Hedgehog regula la proliferación, la apoptosis, la migración y la diferenciación celular; en diversos tipos de cáncer se han descripto anormalidades de esa vía de señalización y recientemente se confirmó la importancia de esta vía en la carcinogénesis de los CC.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar los beneficios antiproliferativos de la capsaicina en diferentes líneas de CC humano.

Materiales y métodos

Se utilizaron las líneas celulares TFK-1 y SZ-1 de CC humano. Mediante inmunoelectrotransferencia (Western blot) se conoció la expresión de cadherina E, cadherina N, vimentina, Gli1 y actina. Se determinó la expresión correlativa de los marcadores de la transición epitelial-mesenquimática (TEM), en relación con la expresión de actina.

En los ensayos de proliferación, las células fueron cultivadas con capsaicina en diferentes concentraciones (150 y 200 µM) durante 1 a 4 días. En cada momento de valoración se incorporaron 10 µl de WST-1, durante dos horas, luego de las cuales se midió la absorbancia.

La invasión celular se analizó con el equipo comercial BioCoat Matrigel Invasion Chamber®. Las células fueron tratadas con capsaicina (150 o 200 µM) y control (dimetilsulfóxido [DMSO]); el índice de invasión se calculó a partir del porcentaje de invasión de las células evaluadas y de las células control. De manera similar se calculó el índice de migración.

El crecimiento independiente de anclaje se determinó en células de las dos líneas, con la finalidad de conocer la capacidad de las células de formar colonias en agar blando, en diferentes condiciones de cultivo, con DMSO o capsaicina, luego de tres semanas de incubación.

La apoptosis se determinó por medio de la fijación de anexina, mediante citometría de flujo. Se extrajo el ARN para conocer la expresión de gli1, gli2, smo1 y 18-sRNA, mediante reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) semicuantitativa. Se determinó la expresión correlativa de los blancos de la vía de Hedgehog en relación con el control GAPDH.

Por medio de transferencia génica con lentivirus se aislaron e inmortalizaron fibroblastos hepáticos humanos. La expresión de los marcadores específicos de fibroblastos (cadherina N, fibronectina, CD90) se valoró por PCR semicuantitativa. Los fibroblastos humanos se cultivaron en las mismas condiciones que las células TFK-1 y SZ-1. Las comparaciones estadísticas se efectuaron con modelos ANOVA y pruebas de la t, con corrección de Bonferroni.

Resultados

Las dos líneas celulares se analizaron con ensayo de citotoxicidad con WST. A partir de curvas de dosis y respuesta se conocieron los efectos de las distintas concentraciones de capsaicina en las células de CC; se determinó la concentración que induce el 50% de inhibición (IC50). El tratamiento con capsaicina durante 24, 48, 72 y 96 horas redujo el número de células viables SZ-1 y TEK-1, de manera dependiente de la dosis y del tiempo. Las imágenes de contraste de fase confirmaron los resultados. Con la finalidad de conocer si los efectos de la capsaicina se limitan a las células tumorales, los experimentos se repitieron con fibroblastos humanos como control. La IC50 calculada para las células malignas difirió de la IC50 de las células normales; la capsaicina afectó la viabilidad de las células normales sólo en concentraciones elevadas.

Con el objetivo de conocer si la menor proliferación y viabilidad de las células de CC, asociadas con la capsaicina, obedecen a la inducción de apoptosis, se valoró el porcentaje de células apoptóticas mediante la fijación de anexina por citometría de flujo. La capsaicina indujo apoptosis de las dos líneas celulares. Los hallazgos confirmaron, entonces, que la capsaicina inhibe el crecimiento celular, de manera dependiente del tiempo y de la dosis, y que el mecanismo es atribuible a la apoptosis.

El efecto de la capsaicina sobre la motilidad se analizó en ensayos de cicatrización de heridas in vitro. La exposición de las células SZ-1 a 150 y 200 µM de capsaicina se asoció con inhibición significativa (p < 0.05) de la cicatrización; si bien la migración de las células TFK-1 tendió a reducirse considerablemente con el tratamiento con capsaicina, la diferencia no fue significativa. Por el contrario, luego de 24 horas se comprobó el 80% de migración en las células cultivadas con DMSO. En el ensayo con Matrigel®, la capsaicina inhibió considerablemente la invasión celular, de manera dependiente de la dosis; se observó un descenso cercano al 90% en el número de células con capacidad de invasión, respecto del grupo control.

La formación de colonias de SZ-1 y de TFK-1 en agar blando permitió conocer los efectos de la capsaicina sobre el crecimiento independiente de anclaje. La capsaicina, en distintas concentraciones, inhibió la formación de colonias, en comparación con las células DSMO. Por lo tanto, los resultados en conjunto sugieren que la capsaicina evita la migración, la invasión y la formación de colonias de las células de CC humano.

En un paso posterior se analizó si la capsaicina ejerce efectos sobre la TEM en las líneas de CC; para ello, las células se expusieron a capsaicina (150 y 250 µM) durante diferentes tiempos, luego de los cuales se determinó la expresión de los marcadores de la TEM mediante Western blot. El tratamiento con capsaicina se asoció con un incremento, dependiente del tiempo, de la expresión del marcador epitelial cadherina E, especialmente en las células TFK-1, y con una disminución, dependiente del tiempo y de la concentración, de la expresión de vimentina en las dos líneas celulares; en cambio, en las células SZ-1 sólo se modificó la expresión del marcador mesenquimático cadherina N a las 24 horas, de modo que el tratamiento con capsaicina parece modular parcialmente la TEM en las células de CC.

Las vías de señalización de Hedhehog han sido involucradas en el crecimiento invasivo de las células de CC; para comprender mejor estos efectos se determinó la expresión de los blancos de esa vía. En las dos líneas celulares, el tratamiento con capsaicina redujo, en relación con el tiempo, la expresión de ARN mensajero de los blancos Gli1 y Gli2, especialmente en las células TFK-1. Mediante RT-PCR semicuantitativa también se comprobó una modificación en la expresión de ARN de la proteína transmembrana Smo, luego de 96 horas. El Western blot confirmó los resultados a nivel proteico. Los hallazgos en conjunto indican que la capsaicina interfiere con el crecimiento, la proliferación y la viabilidad de las células de CC mediante sus efectos sobre la vía de señalización de Hedgehog; sin embargo, los resultados no fueron iguales en las dos líneas celulares.

Discusión

Diversos estudios sugirieron los efectos antitumorales de la capsaicina, en distintos tipos de neoplasias gastrointestinales; sin embargo, la acción de la capsaicina en líneas celulares de CC humano no ha sido evaluada. Por primer vez, en el presente trabajo se demuestra que la capsaicina inhibe eficazmente el crecimiento de las células de CC humano intrahepático (SZ-1) y extrahepático (TFK-1). La capsaicina también induce apoptosis y atenúa la vía de señalización de Hedgehog en estas células.

En trabajos previos se comprobó que la capsaicina induce apoptosis de células Hep-1, HepG2 y de cáncer de páncreas, por medio de mecanismos dependientes de la caspasa 3. En el presente trabajo, la capsaicina indujo apoptosis de las células de CC, pero los índices no fueron elevados, de modo que se requieren más estudios para conocer con precisión todos los mecanismos involucrados en la apoptosis en estas líneas celulares.

La TEM es un conjunto de eventos que permiten la transformación de las células epiteliales adherentes en células fibroblásticas independientes, con capacidad de migración y de invasión de la matriz extracelular. La cadherina E, una proteína cuya expresión se modula durante la TEM, se expresa en los progenitores de células hepáticas y en las células epiteliales biliares. En el presente estudio, la capsaicina afectó parcialmente la TEM; la -cadherina E fue esencial para la inhibición de la invasión y la migración celular, mediadas por la capsaicina. El tratamiento con capsaicina se asoció, de manera dependiente de la dosis, con menor expresión de vimentina, un marcador de células mesenquimáticas. Las células tratadas con capsaicina tuvieron menor capacidad de formar colonias.

La vía de Hedgehog es un regulador importante de la diferenciación celular, la polaridad tisular y la proliferación de las células durante el desarrollo embrionario y la homeostasis de los tejidos adultos. Diversos estudios sugirieron que el bloqueo de esta vía de señalización se asocia con inhibición del crecimiento tumoral. El efecto obedece esencialmente a la neutralización de la actividad de los ligandos de la vía de Hedgehog, la inhibición del receptor serpentina smoothened (SMO) y la supresión de la actividad de los factores de transcripción Gli.

En el presente trabajo, la capsaicina modificó la expresión de los blancos de la vía de Hedgehog a nivel proteico y del ARN. En las dos líneas celulares, la exposición a capsaicina se correlacionó con una menor expresión de los blancos Gli1 y Gli2 de la vía de Hedgehog. La expresión de SMO también se modificó, de manera vinculada con el tiempo.

Los resultados en conjunto indican que la capsaicina ejerce fuertes efectos sobre la proliferación y el proceso de la carcinogénesis in vitro, al bloquear la activación de la vía de Hedgehog. Por lo tanto, es posible que la utilización de suplementos alimentarios con capsaicina se asocie con beneficios terapéuticos adicionales en los pacientes con CC.

Especialidad: Bibliografía - Oncología