El Análisis Proteómico se Asocia con Innumerables Posibilidades Diagnósticas en Diversas Enfermedades

• AUTOR : Blanco-Colio LM, Martín-Ventura JL, Vivanco F y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Biology of Atherosclerotic Plaques: What we Are Learning from Proteomic Analysis
• CITA : Cardiovascular Research 72(1):18-29, Oct 2006
• MICRO : La ruptura de la placa de ateroma es motivo de complicaciones cardiovasculares. El análisis proteómico es una nueva tecnología que parece especialmente útil para comprender la fisiopatología de la aterosclerosis.

Introducción

Aún hoy, la aterosclerosis con sus complicaciones es una de las principales causas de muerte. La enfermedad está relacionada con la hipercolesterolemia y con la inflamación pero los mecanismos patogénicos subyacentes sólo se conocen parcialmente. El análisis proteómico (AP) consiste en la comparación cuantitativa y cualitativa del total de proteínas según sus características, en condiciones fisiológicas o patológicas. Los cambios en la expresión de proteínas, señalan los autores, por lo general sugieren un estado de enfermedad y las mismas pueden representar marcadores con importante valor diagnóstico, pronóstico y terapéutico. Con la aparición de nuevas técnicas para el AP es posible evaluar simultáneamente cientos de proteínas. En esta revisión, los autores resumieron las estrategias del AP, con atención especial en los hallazgos que pueden tener importancia en células vasculares, en las placas de ateroma y en el plasma.

Muestras

Los métodos de AP consisten en la separación de polipéptidos en función de sus características físicas y químicas; en un paso posterior se evalúa su expresión relativa en 2 o más condiciones experimentales. Las desventajas del procedimiento se asocian con la necesidad del procesamiento particular de las muestras y con la imposibilidad de analizar todas las proteínas o péptidos presentes en una solución compleja.

Cultivos de células y de tejidos

El AP puede realizarse en células vasculares pero el cultivo origina cambios en el fenotipo. Por ejemplo, las proteasas que se utilizan para separar las células de músculo liso vascular de la pared arterial también disgregan las interacciones entre células y entre células y la matriz extracelular, un fenómeno que se asocia con aumento de la expresión de moléculas de adhesión y con la síntesis de nueva matriz extracelular. El AP también puede realizarse directamente en muestras de tejidos; sin embargo, en el caso de las placas ateroscleróticas, el procedimiento es complejo porque las placas difieren notablemente en la cantidad de lípidos y en la magnitud de la hemorragia, la fibrosis y la calcificación. El AP diferencial requiere la comparación de por lo menos 2 condiciones distintas; en el caso de las lesiones de ateroma, debe realizarse una comparación con los proteomas de las arterias sanas, difíciles de obtener en condiciones parecidas.

Los tejidos deben ser homogeneizados para su análisis posterior; sin embargo, la información que se obtiene a través del AP es limitada por la presencia de gran cantidad de proteínas. El tejido aterosclerótico puede ser disgregado con láser, un procedimiento que permite comparar diferentes regiones de la placa y obtener información importante en términos espaciales.

La espectrometría de masa (EM) es una técnica nueva que permite definir los patrones de expresión proteica directamente en secciones de tejidos. Además, el procedimiento brinda información acerca de la distribución espacial de las proteínas en este tejido, de forma tal que puede realizarse una comparación entre zonas sanas y enfermas en secciones del mismo tejido y en cortes diferentes. La EM también es útil para establecer correlaciones entre los cambios en el contenido de proteínas en regiones histológicas precisas. En la actualidad, el método se aplica en la identificación de proteínas en tumores pero también podría ser útil para evaluar distintas regiones en las placas de ateroma.

Muestras de sangre

El compartimiento sanguíneo es fácilmente evaluable con AP; pueden detectarse marcadores con utilidad diagnóstica y pronóstica y también permite conocer la respuesta al tratamiento en una enfermedad específica. Además, añaden los autores, la sangre puede reflejar de manera directa o indirecta un estado vascular alterado. En el caso de que se pretendan identificar marcadores de aterosclerosis coronaria, la muestra de sangre debe obtenerse unas pocas horas después de la revascularización, dado que los stents inducen cambios importantes en el proteoma sanguíneo que pueden encubrir los marcadores ateroscleróticos presentes en condiciones basales.

¿Suero o plasma? El plasma se obtiene cuando se toma una muestra de sangre en un tubo con anticoagulante, mientras que el suero se consigue después de la centrifugación de una muestra obtenida sin anticoagulante. La coagulación es un proceso que involucra la activación secuencial de proteasas hasta la formación del coágulo con plaquetas y linfocitos activados. Estas células activadas pueden liberar muchas proteínas y proteasas que pueden afectar sustancialmente el proteoma. Por ende, la estandarización del proceso de obtención de la muestra es un paso esencial en el AP.

Células circulantes. El AP de células circulantes presenta las mismas complicaciones, dado que la toma y el procesamiento de la muestra pueden asociarse con activación celular. El proteoma de las células contaminantes puede afectar sustancialmente el análisis del proteoma de interés.

Diferentes estrategias de AP

El objetivo del AP diferencial es separar, visualizar y cuantificar las proteínas presentes en una mezcla compleja, para poder detectar diferencias en la expresión de proteínas en 2 o más situaciones experimentales.

Procesamiento de la muestra

La solubilización de las proteínas es un paso relevante; por lo general, es importante que no se modifique la carga iónica de las proteínas, dado que éstas se separan en función de sus propiedades cromatográficas o por el punto isoeléctrico. Habitualmente en este paso se emplean detergentes no iónicos. Cuando la concentración de las proteínas es muy baja o cuando la muestra tiene sales que pueden interferir con las técnicas de separación puede ser necesario efectuar precipitación o concentración de la muestra,; por ejemplo, con diálisis o dispositivos de centrifugación.

Separación y visualización

El método más común de separación proteica en el AP es la electroforesis bidimensional, que incluye la separación de las proteínas por su punto isoeléctrico seguida de la electroforesis en gel de poliacrilamida (en función de la masa molecular). Existen gradientes comerciales para tal fin. La visualización de las proteínas después de su separación es un paso que también debe estar estandarizado; en general, se emplean procedimientos de coloración (azul de Coomassie y tinción con plata o con marcadores fluorescentes). La visualización por fluorescencia se asocia con la mayor sensibilidad. Cualquiera sea el método de marcación, éste debe ser compatible con la EM. Con la finalidad de poder evaluar más de una muestra simultáneamente se crearon algunas modificaciones en el procedimiento convencional,; por ejemplo, la electroforesis diferencial en gel, que permite la fácil comparación de 2 o más muestras o más.

Identificación

Después de la separación se deben identificar las proteínas aisladas en geles de poliacrilamida o purificadas por cromatografía. En este paso en general se emplean modificaciones de la EM (time-of-flight mass spectrometry). En algunos casos se efectúa ionización mediante la cristalización de la muestra con compuestos orgánicos (matriz) expuestos a un pulso láser que vaporiza los péptidos. Cualquiera sea el método de ionización, la digestión específica de una proteína en particular genera una impronta que puede compararse con la de proteínas conocidas. Sin embargo, señalan los expertos, este método de identificación tiene múltiples problemas, en especial cuando se obtiene un número reducido de péptidos. Además, las proteínas que no se identificaron con anterioridad no figuran en las bases de datos.

Análisis de péptidos múltiples

Algunas estrategias incorporadas recientemente permiten la separación y la cuantificación de péptidos que se obtienen a través de diversos procedimientos de digestión. La tecnología de afinidad con isótopos (isotope-coded affinity tag) se basa en la codificación diferencial de las muestras según los aminoácidos; permite la cuantificación relativa de 2 o más poblaciones proteicas mediante la comparación de las intensidades pico de los péptidos que difieren en 8 Da. Después de la marcación de las proteínas se combinan las 2 muestras y se realiza la digestión y la purificación antes de la EM.

Ventajas y desventajas de las tecnologías proteómicas

Las diversas técnicas son complementarias entre sí. El análisis bidimensional permite la separación de cientos de proteínas por gel pero tiene escaso poder de resolución; además, se requiere gran volumen de la muestra inicial (más de 50 µg de proteínas). La cromatografía líquida permite la identificación directa de amplio número de proteínas por muestra pero el procedimiento completo lleva mucho tiempo.

AP de las células vasculares

Condiciones fisiológicas

El mapa de expresión proteica de las células vasculares endoteliales de cordón umbilical fue el primero que se describió. Se identificaron 53 proteínas en células endoteliales inactivadas. Además de las proteínas del citoesqueleto (actina, tubulina, tropomiosina y vimentina) se observaron diversas proteínas, especialmente involucradas en la regulación de la apoptosis y en el envejecimiento celular, y otros péptidos que participan en la coagulación y en la presentación de antígenos. El AP de vena safena humana reveló aproximadamente 130 proteínas, mientras que el de la arteria mamaria interna mostró 83 proteínas intracelulares. La información en conjunto es de gran utilidad para evaluar el efecto de los estímulos proaterogénicos sobre la expresión de proteínas nuevas y para comparar su expresión basal respecto de la de células en situaciones patológicas.

Condiciones fisiopatológicas

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial en la que participan diversos factores de riesgo, entre ellos, la hipertensión, la hiperlipidemia y la diabetes. Sin embargo, por el momento poco se sabe acerca del proceso de la formación de la placa de ateroma. La progresión de la placa está favorecida por factores hemodinámicos y por trastornos en la expresión de moléculas de superficie en las células de músculo liso vascular (CMLV) expuestas al estrés hemodinámico. Se considera que la proliferación y la migración de estas células son eventos cruciales en la patogenia de la aterosclerosis. En la inflamación, estrechamente asociada con la aterosclerosis, participan diversas citoquinas, entre ellas, el factor de necrosis tumoral (TNF [tumour necrosis factor]) alfa, que son esenciales en el inicio y en la progresión de las lesiones. Se ha observado que el tratamiento de las CMLV con TNF-alfa o con ácido alfa-lipoico se asocia con modificación en la expresión de diversas proteínas, por ejemplo, el inhibidor 2 del activador del plasminógeno. El TNF-alfa y el ácido alfa-lipoico ejercen efectos opuestos en este sentido. La catepsina D y la proteína de unión a ácidos grasos de células adiposas son buenos marcadores de la maduración de macrófagos. Los experimentos celulares mencionados son fáciles de realizar; sin embargo, los resultados que se obtienen con su AP no necesariamente reflejan los eventos moleculares complejos que tienen lugar en la placa de ateroma.

AP de tejidos

Es un procedimiento complejo por la composición celular heterogénea de las lesiones ateroscleróticas. En vasos sanos se observa el predominio de CMLV, pero en los dañados hay enorme cantidad de células inflamatorias y de glóbulos rojos; lo mismo sucede en proteínas y lípidos celulares modificados. En los primeros tiempos, el perfil de expresión génica de las placas de ateroma se comparó con el de la pared de los vasos sanos. Estos estudios mostraron diferencias en la expresión de una amplia variedad de genes, la mayoría involucrados en la inflamación, apoptosis y trombosis. Luego se intentó definir el perfil de expresión genética de placas vulnerables y estables. Más recientemente algunos grupos efectuaron AP de las placas de ateroma humanas. En este contexto se compararon extractos titulares de lesiones con abundancia de grasa y segmentos de aorta humana sana; sólo se detectaron diferencias en términos de la expresión de proteínas de origen plasmático. Otro grupo, en cambio, encontró mayor expresión de la cadena liviana de la ferritina (una proteína involucrada en el almacenamiento de hierro en las células) en coronarias de sujetos con enfermedad coronaria. Se constató la expresión de 6 isoformas de la alfa-1- antitripsina (ATT) en placas avanzadas y sólo 1 de las isoformas se expresó en las placas con trombos. La mayor expresión de ATT en lesiones con trombos podría reflejar un mecanismo de defensa por la actividad antielastasa de la ATT. Otro grupo mostró una expresión sustancialmente mayor de 7 proteínas, una de ellas la del gen 2 asociado con apoptosis. Debido a que la apoptosis confiere vulnerabilidad a las placas de ateroma, el descenso de la expresión de este gen sugeriría un nuevo mecanismo de defensa en las placas ateroscleróticas humanas. Por último, señalan los autores, el AP podría ser de gran ayuda para evaluar el efecto de una terapia determinada.

AP de secretomas

El secretoma, señalan los expertos, incluye todas las proteínas secretadas o liberadas por las células o los tejidos en el compartimiento extracelular. El AP del secretoma es de gran interés en patología vascular, dado que podría asociarse con la identificación de nuevos marcadores con valor diagnóstico. Un estudio reciente en CMLV arterial en cultivo reveló el secretoma: 18 proteínas diferentes secretadas por estas células en el medio de cultivo. Estas proteínas están involucradas en numerosas funciones biológicas, como la proteólisis (metaloproteinasas), la regulación de la fibrinólisis (proteína activadora del plasminógeno, PAI-1) y en mecanismos de defensa. El estrés oxidativo es otro de los procesos que participa en la formación y en la progresión de la placa de ateroma. La cromatografía para el análisis de las proteínas liberadas por CMLV reveló la expresión de la HSP90 y de la ciclofilina B en respuesta al estrés oxidativo. Las ciclofilinas secretadas revisten importancia especial porque están involucradas en la regulación del crecimiento de las células y en las respuestas inflamatorias.

El secretoma de macrófagos humanos incluye 38 proteínas diferentes y las proteínas que se secretan al medio también tienen múltiples funciones biológicas. En un modelo in vitro de «células espumosas», el AP del secretoma reveló cambios en la expresión de 59 proteínas en respuesta a las lipoproteínas de baja densidad normales u oxidadas. De nuevo, diversos estudios previos sugirieron que algunas de estas proteínas participan en la aterosclerosis.

Los autores compararon el secretoma de tejido arterial sano y patológico con una estrategia proteómica diferencial con el objetivo de identificar nuevos marcadores biológicos potencialmente liberados por la pared vascular. La incubación de muestras vasculares obtenidas por endarterectomía y de controles en medio libre de proteínas permitió el análisis distintivo en condiciones patológicas y fisiológicas, sin la interferencia de las proteínas del plasma. Mediante esta estrategia se identificó un número importante de proteínas liberadas específicamente por vasos sanos o dañados; las proteínas pertenecen a diferentes grupos funcionales e incluyen enzimas, proteínas estructurales, transportadores, factores de transcripción, antioxidantes y proteínas de defensa frente al estrés oxidativo. En comparación con las arterias mamarias sanas, las lesiones de ateroma liberan menos HSP27. Además, se constató que la concentración de HSP27 es menor en el suero de pacientes con aterosclerosis, un fenómeno que sugiere que la proteína podría ser un nuevo marcador biológico en aterosclerosis.

El AP de tejidos también permite evaluar su significado biológico y se han identificado nuevas vías metabólicas que representan posibles objetivos terapéuticos. Según los expertos, la disminución de los niveles plasmáticos de la HSP27 podría atribuirse a una mayor degradación, un proceso que se correlacionaría con la magnitud de la placa. La información en conjunto sugiere que la HSP27 podría ser un marcador sensible en la aterosclerosis.

AP del plasma

Es muy interesante desde el punto de vista clínico porque brinda información del estado fisiológico de diferentes tejidos. Sin embargo, la enorme variedad de proteínas presentes en el plasma hace difícil el AP. Nueve proteínas principales representan el 90% del proteoma, otras 12 contribuyen un 9% y el análisis del 1% restante representa un gran desafío. El análisis se simplifica si se reduce el objetivo, por ejemplo, a la valoración del proteoma de las lipoproteínas involucradas en la aterogénesis. Sin embargo, las lipoproteínas pueden actuar como vehículos de proteínas específicas que deben ser identificadas. El AP de las lipoproteínas reveló nuevas proteínas cuya acción debe establecerse. La concentración elevada de algunas proteínas plasmáticas -albúmina e inmunoglobulinas- complica el AP del plasma. En lesiones coronarias agudas se identificaron proteínas que se expresan distintivamente en el plasma de los pacientes.

Conclusiones

En los últimos años se incorporaron nuevas tecnologías que permitirán comprender mejor la fisiopatología de numerosas enfermedades, entre ellas, la de la aterosclerosis. Sin embargo, cualquier técnica tiene ventajas y desventajas que deben tenerse muy en cuenta en el momento de interpretar los resultados, concluyen los especialistas.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología - Farmacología