El Butirato Retrasa la Evolución de la Esclerosis Lateral Amiotrófica al Actuar sobre la Microflora Alterada

• TITULO : El Butirato Retrasa la Evolución de la Esclerosis Lateral Amiotrófica al Actuar sobre la Microflora Alterada
• AUTOR : Zhang Y, Wu S, Sun J y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Target Intestinal Microbiota to Alleviate Disease Progression in Amyotrophic Lateral Sclerosis
• CITA : Clinical Therapeutics 39(2):322-336, Feb 2017
• MICRO : Los microbiomas anómalos y la pérdida de la homeostasis intestinal están estrechamente relacionados con la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica. El uso de butirato permitiría restablecer ambas situaciones al preservar la función neuromuscular y frenar el inicio y la progresión de la enfermedad.

Introducción y objetivos

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa mortal, con un riesgo de 1 cada 472 mujeres y 1 cada 350 hombres en el mundo.

Prácticamente no existen medidas que logren una mejoría notable en el curso de la enfermedad. El riluzol, único fármaco aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la ELA, aumenta la esperanza de vida apenas unos meses. Por lo tanto, es necesario encontrar cuanto antes nuevas estrategias para detener la progresión de esta enfermedad y mejorar la calidad de vida de quienes la padecen.

En la ELA familiar, 20% a 25% de los casos se deben a mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa 1 Cu/Zn (SOD1). Existe un modelo de ELA murino (ratones G93A) con una mutación causante de la enfermedad en el gen SOD1 que origina síntomas neuronales y musculares similares a los de los pacientes con ELA. Un estudio reciente dio a conocer un interesante fenotipo que conectaba la homeostasis microbiana e intestinal anormal con la progresión de la enfermedad en ratones con ELA. Los ratones G93A presentan disbiosis (perfil bacteriano intestinal desequilibrado), una estructura de unión estrecha (UE) interrumpida y una permeabilidad intestinal exacerbada (síndrome del intestino permeable). Estas alteraciones se producen en ratones G93A jóvenes antes de la aparición de los síntomas de la ELA, lo que parece indicar que la comunicación intestino-neuromuscular obstaculizada podría contribuir de manera activa a la progresión de la enfermedad y a su patogenia. El microbioma intestinal modula muchos factores de la fisiología humana y es fundamental en la aparición de enfermedades crónicas. Las células epiteliales del intestino están permanentemente expuestas a las bacterias, lo cual tiene importantes efectos en el desarrollo, la renovación y la inmunidad. La pérdida de la homeostasis intestinal y un microbioma anormal traen aparejados trastornos neurológicos, como el autismo y la enfermedad de Parkinson.

Este estudio sin precedentes propone que el restablecimiento de ambos factores alterados (microbioma y homeostasis intestinal) retrasa el comienzo y la progresión de la ELA, y analiza el butirato como un agente que promueve dichas modificaciones, con lo que se plantea una nueva forma de enfrentar la enfermedad.

Materiales y métodos

Se utilizaron ratones G93A5 y salvajes (wild-type, WT) de edades similares.

Los ratones G93A, de entre 8 y 9 meses de edad, se ubicaron en 2 grupos al azar: el tratado con butirato y el de control. El primero recibió butirato de sodio al 2% diluido en agua potable filtrada. El tratamiento comenzó a los 63 días de vida y concluyó después de 2.5 meses. El segundo recibió agua potable filtrada sin butirato. El estiramiento limitado de las patas traseras al levantar al animal por la cola se tomó como síntoma de ELA; los ratones que no lograron darse vuelta en el lapso de 30 segundos luego de ser acostados de espaldas fueron sacrificados.

Se aislaron los tejidos intestinales, se fijaron con formol neutro al 10% y se embebieron en parafina.

Para el estudio de la permeabilidad de un agente fluorescente in vivo se administró fluoresceína por sonda (50 mg/g de ratón). Cuatro horas después, se tomaron muestras de sangre mediante punción cardíaca.

Se realizó el recuento de células de Paneth en el íleon de ratón luego de la tinción por inmunofluorescencia antilisozima. Los patrones de expresión de la lisozima en las células de Paneth se clasificaron como normales o anormales; estos últimos incluían células desorganizadas, deplecionadas y difusas, según los procedimientos publicados.

Se realizó la transfección de células HCT116 con plásmidos con la proteína verde fluorescente (GFP, por su sigla en inglés) fusionada a la SOD humana, una SOD1G93A-GFP mutante o una WT SOD1-GFP humana.

Se cultivaron las células HCT116 transfectadas con SOD1G93A-GFP con 2 mmol/L de butirato o sin él. Cuarenta y ocho horas después se buscaron agregados proteicos en las células HCT116 vivas mediante microscopia confocal.

Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real para extraer el ARN total de las células epiteliales del íleon de ratón o de células cultivadas. Se normalizaron todos los niveles de expresión a los de la β-actina de la misma muestra. Se calculó el porcentaje de expresión como la relación entre el valor normalizado de cada muestra y aquel correspondiente a las células de control no tratadas.

Se realizó el muestreo y la secuenciación microbianos. Se aislaron heces fecales (frescas) y cecales del intestino.

Se llevó a cabo la clasificación taxonómica mediante el contraste con datos del National Center for Biotechnology Information. Se asignaron los genomas bacterianos según su parecido con las secuencias de referencia GreenGenes.

Resultados

Se evaluaron los efectos del butirato en la progresión de la ELA en ratones.

La estrategia consistió en alimentar a los ratones con ELA desde el mes 1 de vida con butirato al 2% en agua potable. A la edad de 110 días se observó pérdida de peso en los ratones de control G93A (un indicio de aparición de ELA), mientras que en los G93A tratados con butirato esa pérdida se produjo a los 150 días. La alimentación de los ratones en el modelo ELA con butirato extendió la esperanza de vida, en promedio, 38 días, con lo que el tratamiento con este fármaco retrasaría la progresión de la ELA en los ratones G93A.

Se encontró que los ratones con ELA presentaban un microbioma intestinal anómalo, con disminución de las bacterias productoras de butirato (Butyrivibrio fibrisolvens). Esta modificación se da en los ratones con ELA jóvenes antes de que se manifieste la enfermedad. La síntesis de butirato por bacterias anaerobias puede producirse a través de la butiril-CoA: acetato CoA transferasa. También se observó que el nivel de CoA era mucho menor en los ratones G93A carentes de síntomas de la enfermedad que en los G93A WT y los transgénicos. Asombrosamente, el tratamiento con butirato de sodio oral al 2% durante 2.5 meses se relacionó con un aumento considerable de las bacterias Butyrivibrio fibrisolvens productoras de butirato y, a la vez, fomentó un notable restablecimiento de la expresión de CoA.

Luego se juntaron las muestras de materia fecal de ratones con ELA con butirato y sin él para la secuenciación del ADNr 16S. Se observaron modificaciones en el perfil microbiano intestinal de los ratones con ELA tratados con butirato. El fármaco ocasionó un importante aumento de las bacterias Butyrivibrio spp. productoras de butirato a nivel de género, mientras que a nivel de especie, tras 2.5 meses de tratamiento (a la edad de 3.5 meses) los ratones con ELA tratados con butirato se habían enriquecido notablemente en especies de Clostridium y Ruminococcus. En conjunto, estos resultados autorizan a pensar que el butirato mejora la disbiosis e incrementa la diversidad del microbioma en los ratones con ELA.

Las uniones estrechas entre las células epiteliales intestinales adyacentes constituyen la barrera intestinal. Antes del inicio de la ELA se hallaron cambios tempranos en esas uniones en los ratones G93A. Luego se propuso que el restablecimiento de la homeostasis intestinal podría retrasar el comienzo y la progresión de la enfermedad. La administración durante 2.5 meses de butirato se asoció con una importante recuperación de la expresión de la proteína de unión estrecha ZO-1 y de la estructura de estas uniones en el intestino G93A. Por lo tanto, el butirato mejoraría las estructuras anormales de las uniones estrechas intestinales en los ratones con ELA.

Se estudió la permeabilidad intestinal en los ratones con ELA mediante una sonda con fluoresceína-dextrano. El nivel sérico de la fluoresceína fue 3 veces superior en los ratones G93A, lo que indica que estos presentan un intestino permeable.

Para evaluar el papel del butirato en la permeabilidad intestinal, se trabajó con un modelo in vitro de una célula epitelial intestinal humana polarizada. Las células humanas HT29C19A adquirían una resistencia transepitelial mucho mayor con el butirato, de lo que se deduce que el fármaco actúa positivamente en el intestino permeable al incrementar la función epitelial.

Las células de Paneth, células epiteliales intestinales especializadas con actividad autofágica, regulan las interacciones entre las bacterias intestinales y el hospedero. Se observó una caída de las células de Paneth anormales en los animales tratados con butirato.

La proporción de células de Paneth anormales disminuyó considerablemente en el intestino de los ratones tratados con butirato con respecto a los no tratados, hecho que sugiere el restablecimiento de estas células por el uso del fármaco.

Discusión

Según el presente estudio, hay una asociación entre los microbiomas anómalos, la pérdida de la homeostasis intestinal y la fisiopatología de la ELA en el modelo de ratón. A su vez, la restitución de ambas situaciones mediante el uso de butirato preservaría la función neuromuscular y frenaría así el inicio y la progresión de la enfermedad.

Esta investigación es un disparador de búsqueda de nuevas estrategias de atenuación del fenotipo de la ELA y el retraso de su evolción. Probablemente las alteraciones fisiopatológicas de diversas enfermedades, incluida la ELA, podrían revertirse mediante el aumento de los niveles de butirato o de otros ácidos grasos de cadena corta.

No se ha estudiado anteriormente el papel preciso del butirato en el funcionamiento intestinal y microbiano en la ELA. Se sabe que la ELA originada por una mutación en SOD1 lleva a la formación de agregados proteicos en las neuronas y las células musculares esqueléticas. No obstante, no se investigó si dicha mutación provoca un fenotipo patológico parecido en el intestino.

Se demostró que la proteína mutante SOD1G93A forma agregados en el intestino de los ratones con ELA y células epiteliales intestinales humanas, lo que supone que cumple una función fundamental en las alteraciones fisiopatológicas del intestino. Los cambios patológicos probablemente sean un reflejo de los cambios en el microbioma de los ratones G93A. Cabe destacar que la aplicación oral de butirato permitió restablecer la homeostasis microbiómica e intestinal en los ratones G93A.

Los hallazgos de este estudio destacan el complejo papel del microbioma y del epitelio intestinal en el desarrollo de la ELA y el del butirato en la restitución de la disbiosis asociada con esta patología.

Las irregularidades gastrointestinales propias de la ELA previas a la aparición de los síntomas neurodegenerativos han sido obviadas en gran medida. La proteína mutante ligada a ELA ,SOD1G93A, produce disfunción intestinal y un microbioma anómalo como parte de la patología. Si se apuntara a las interferencias entre el intestino y el sistema neuromuscular se lograría mejorar la disbiosis y restablecer las uniones estrechas intestinales, las células de Paneth y las bacterias beneficiosas y, por lo tanto, como se vio en el modelo murino de ELA, la esperanza de vida sería mayor, lo que constituiría un modo novedoso de preservar la integridad fisiológica en la ELA.

Conclusiones

Los resultados de este estudio avalan el papel primordial del microbioma intestinal en la patogenia y la fisiopatología de las enfermedades de los órganos distales. Asimismo, aporta conceptos de vanguardia en el área de la investigación de la ELA y tiene consecuencias translacionales muy importantes para la detección de nuevos biomarcadores diagnósticos y para el desarrollo de terapéuticas novedosas que permitan luchar contra esta terrible afección.

Especialidad: Bibliografía - Neurología