El Papel del Acido Hialurónico sobre el Cartílago en la Artrosis

• AUTOR : Fioravanti A, Cantarini L, Collodel G y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Effect of Hyaluronic Acid (MW 500-730 kDa) on Proteoglycan and Nitric Oxide Production in Human Osteoarthritic Chondrocyte Cultures Exposed to Hydrostatic Pressure
• CITA : Osteoarthritis and Cartilage 13(8):688-696, Ago 2005
• MICRO : El ácido hialurónico ejerce un efecto protector sobre los condrocitos, que contrarresta los efectos deletéreos de la interleuquina 1-beta y favorece los observados con la presión hidrostática.

Introducción

La artrosis se caracteriza por la destrucción del cartílago articular. La degeneración de los proteoglucanos y el colágeno sería el resultado de un mayor catabolismo por los condrocitos.
La interleuquina 1-beta (IL-1-beta) es una citoquina que participa en la degradación del cartílago articular; estimula la secreción de metaloproteinasas y óxido nítrico (NO) por parte de los condrocitos. Además, inhibe fuertemente síntesis de proteoglucanos y colágeno.
El NO es un radical libre extremadamente reactivo, citotóxico, que participa en diversas lesiones tisulares. Cada vez hay más pruebas de que también desempeñaría un papel en la aparición de la artrosis; se señalaron concentraciones mayores de NO en el suero y en el líquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoidea y artrosis. El NO además ejerce diversos efectos sobre los condrocitos: inhibe la síntesis de la matriz, la activación de las metaloproteinasas, induce apoptosis y reduce los niveles del antagonista de los receptores de IL-1 (IL-1Ra).
La mayor síntesis de NO también contribuiría a la excesiva producción de prostaglandina E2 (PGE2) y tendría un papel esencial en la nocicepción.
Diversos estudios in vitro destacaron la importancia de la compresión mecánica y la presión hidrostática como moduladores del metabolismo del cartílago. Los condrocitos responden a la carga de peso intermitente con un aumento en la secreción de proteoglucanos, mientras que la carga continua origina la respuesta opuesta. Los efectos de la presión hidrostática afectan las proteínas, el citoesqueleto y las organelas intracelulares; la compresión del cartílago resulta en la deformación de las células y la matriz extracelular, y cambios físico-químicos como alteración del contenido acuoso de la matriz, la densidad de carga fija, las concentraciones iónicas y la presión osmótica.
El ácido hialurónico (AH) es un componente de los proteoglucanos de la matriz del cartílago. Es sintetizado por los condrocitos, fibroblastos y sinoviocitos, y se liberan a la matriz extracelular y el líquido sinovial. En la artrosis disminuye el contenido cartilaginoso y sinovial de AH.
Las inyecciones intraarticulares de AH, de peso molecular de 500-730 kDa, se usaron durante varios años en el tratamiento de la artrosis. Diversos estudios clínicos controlados demostraron que cinco inyecciones intraarticulares de este producto reducían significativamente el dolor y mejoraban la función en pacientes con artrosis de rodilla durante varios meses. También tendría algún efecto modificador sobre la estructura.
Los cultivos de condrocitos representan un modelo biológico válido y simple para probar los efectos de diversos fármacos y agentes (citoquinas, hormonas y factores de crecimiento) y para evaluar la influencia de la presión hidrostática sobre su morfología y estructura.
En este trabajo, sus autores analizaron in vitro los efectos del AH en condrocitos humanos cultivados en presencia o ausencia de IL-1beta durante 48 horas, con y sin presión hidrostática cíclica de magnitud y frecuencia similares a las que afectarían al cartílago articular. En estas condiciones se analizó el efecto de AH ± IL-1beta mediante evaluaciones metabólicas (niveles de proteoglucanos y producción de NO en el medio de cultivo) y morfológicas (mediante microscopio electrónico de transmisión [MET] y microscopio electrónico de barrido [MEB]).

Métodos

Se obtuvo cartílago humano de la cabeza femoral de cinco pacientes con artrosis, definida clínica y radiológicamente de acuerdo con los criterios del American College of Rheumatology, sometidos a reemplazo total de cadera. La media de edad del grupo era de 68 años (intervalo 63-71).
Macrosópicamente no se observaron alteraciones en el cartílago; histológicamente se vieron cambios artrósicos típicos como la presencia de condrocitos agrupados, pérdida de la metacromasia y fibrosis. Inmediatamente después de la cirugía, las muestras de cartílago se redujeron a trozos de 2 mm2 que se digirieron mediante colagenasa de Clostridium en un medio con solución salina amortiguada con fosfato, penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Los condrocitos obtenidos después de la digestión con colagenasa se enjuagaron en la solución salina A (en Mm: 10 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil] ácido etanosulfónico (HEPES), 140 NaCl, 5 ClK, glucosa 5, pH 7.4) y se centrifugaron durante 10 minutos a 700 g.
Las células se cultivaron en 24 microplacas a una densidad de 5×105 cél/pozo con un sobrenadante de 1 ml de medio con 10% de suero fetal bovino, 200 UI/ml de penicilina, 200 µg/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina en el medio esencial Dulbecco. Las células se mantuvieron en una atmósfera de 5% de CO2 en el aire, a 37°C durante 48 horas.
En los condrocitos cultivados se analizaron los efectos de AH (MW 500-730 kDa) en presencia de IL-1beta. Se agregó el AH en concentraciones de 10 y 100 µg/ml en el medio, con 5 ng/ml de IL-1beta recombinante humana o sin ella. Después de 48 horas se removió el medio y se almacenó a -70°C para determinar luego el contenido de proteoglucanos y NO.
La producción de proteoglucanos y NO en las muestras de cultivo al inicio y después de su incubación en presencia de IL-1beta, sola o con distintas concentraciones de AH con o sin presurización se analizó en el medio de cultivo removido después de las 48 horas de incubación.
El sistema de presurización constaba de un cilindro de acero herméticamente cerrado mantenido a 37°C; la presurización se obtenía con energía hidráulica, y podía modificarse a lo largo del experimento, entre valores de 0 a 24 Hpa.
Se cultivaron los condrocitos en placas de Petri. Después de 48 horas las placas se llenaron con el medio de cultivo y se sellaron con una membrana, luego de extraer el aire. La membrana usada es especialmente permeable al O2 y al CO2, pero no al agua u otras soluciones. Durante los experimentos, las placas se sumergieron en agua destilada precalentada (37°C).
Los condrocitos cubiertos por el medio de cultivo fueron presurizados mediante ondas sinusoidales con una presión mínima de 1 MPa, una presión máxima de 5 MPa y una frecuencia de 0.25 Hz durante tres horas. Las placas no sometidas a presión funcionaron como controles. Luego de la presurización se recolectó el medio de cultivo y se almacenó a -70°C para determinar la presencia de proteoglucanos y NO mediante MET y MEB.
La cantidad de proteoglucanos en el medio de cultivo se determinó mediante un método inmunoenzimático.
Los resultados se expresan como promedios ± desviación estándar de la liberación de proteoglucanos y NO al medio de cultivo por cada 105 células. Se consideró significativo un valor de p < 0.05.

Resultados

Se analizó la concentración total de proteoglucanos en el medio de cultivo durante 48 horas en condiciones iniciales, en presencia de un estimulante del daño articular (IL-1beta en concentraciones de 5 ng/m) y en presencia de IL-1beta y AH en las dos concentraciones del estudio (10 y 100 µg/ml). La presencia de IL-1beta determinó un pequeño pero significativo descenso (p < 0.001) en los niveles de proteoglucanos, pero cuando las células se cultivaron en presencia de IL-1beta y AH se observó una restauración significativa de la producción de proteoglucanos (HA 10: p < 0.05; AH 100: p < 0.01). Dicha restauración dependió de la dosis de AH.
Los niveles de proteoglucanos se incrementaron significativamente en el medio de cultivo (p < 0.001), pero la presurización no los aumentó sustancialmente en presencia de IL-1beta. Bajo condiciones de presurización el agregado de AH determinó un incremento significativo (p < 0.001).
La presencia de IL-1beta determinó un aumento importante en la síntesis de NO (p < 0.001), pero cuando las células se cultivaron en presencia de IL-1beta y AH se observó una disminución sustancial (p < 0.001).
La presurización inicial se asoció con un descenso escaso y no significativo de los niveles de NO; pero en presencia de IL-1beta determinó un descenso sustancial (p < 0.05). El agregado de AH indujo una disminución adicional también significativa y dependiente de la dosis.
Los resultados metabólicos se confirmaron con los hallazgos morfológicos obtenidos por MET y MEB. Las células no presurizadas mostraron núcleos eucromáticos, citoplasma con retículo endoplásmico rugoso (RER) y gotitas lipídicas; en presencia de IL-1beta los condrocitos mostraron varias vacuolas citoplasmáticas. El agregado de AH se asoció con un descenso en la cantidad de vacuolas y de RER.
Después de la presurización, las células mostraron un citoplasma rico en RER y mitocondrias; en presencia de IL-1beta, estos se limitaron a una parte del citoplasma que también contenía una cantidad de vacuolas. Con el agregado de AH se observó una recuperación de las estructuras celulares. A nivel microscópico, los condrocitos mantuvieron inicialmente su forma esférica y presentan algunos granos secretorios y fibrillas de colágeno. En presencia de IL-1beta mostraron una pérdida de los procesos citoplasmáticos y alteraciones de su superficie. Después de la presurización, en presencia de IL-1beta y AH a ambas concentraciones, la morfología de la superficie de los condrocitos se recuperó.

Discusión

El estudio presentado describe que los efectos de la IL-1beta y el AH, analizados en presencia y ausencia de presurización hidrostática cíclica, sobre la morfología de los condrocitos artrósicos in vitro y sobre la producción de proteoglucanos y NO. Actualmente se acepta que la IL-1beta es un mediador importante en la destrucción del cartílago observada en la artrosis. Provoca el aumento de la síntesis de metaloproteinasas, inhibe la síntesis de inhibidores fisiológicos mayores de estas enzimas y la de proteoglucanos y colágeno.
Los experimentos descritos señalan que el agregado de IL-1beta produce una disminución en la concentración de proteoglucanos en el medio de cultivo. Esto podría deberse a su efecto inhibitorio sobre la síntesis de proteoglucanos por parte de los condrocitos.
Los aspectos morfológicos muestran signos de sufrimiento celular mediante la presencia de vacuolas y la falta de organelas celulares característicamente responsables de la síntesis de las glucoproteínas de la matriz. Cuando las células se cultivan en presencia de IL-1beta y AH, se restauran los niveles de proteoglucanos en el medio de cultivo. Esto coincide con datos previos sobre el efecto inhibitorio del AH acerca de las acciones de la IL-1beta sobre los condrocitos. La evaluación estructural confirma estos hallazgos bioquímicos; los condrocitos presentan una buena organización citoplasmática después del agregado de AH.
El cartílago articular está sometido constantemente a cargas, que varían en función del peso corporal, la tensión muscular, la postura y la actividad física. La presión hidrostática es uno de los diversos factores que actúan sobre el cartílago.
En este estudio la presión aplicada fue similar a la correspondiente al rango fisiológico en las articulaciones humanas. De hecho, la presión aumenta hasta 18 MPa en las articulaciones de la cadera; sin embargo, los niveles hallados más frecuentemente en la rodilla de 5 MPa durante una caminata normal.
Los condrocitos sometidos a una presurización fisiológica mostraron una mayor actividad metabólica manifestada por un incremento significativo en los niveles de proteoglucanos en el medio de cultivo inicial. Esto también se demostró en los análisis morfológicos con MET y MEB; los condrocitos mostraron una mejora notable en sus características celulares, que confirma la transición hacia una actividad más anabólica.
En opinión de los autores, el aumento en los niveles de proteoglucanos en el medio de cultivo en condiciones iniciales podría responder a una estimulación de la actividad celular mediada por la presurización cíclica, como ya fuera demostrado en otras ocasiones.
La presión hidrostática modularía la biosíntesis de agrecano (un proteoglucano) por vías mediadas por membranas, como el transporte de cationes, aminoácidos y macromoléculas. También podría afectar la acción de la bomba de membrana de Na/K y, así, las concentraciones intracelulares de potasio.
Por otro lado, el adenosín monofosfato cíclico (AMPc), identificado como un mediador importante en la síntesis de proteoglucanos y el crecimiento del cartílago, desempeñaría un papel destacado en la estimulación mecánica de la biosíntesis de la matriz. Las presiones hidrostáticas constantes que inhiben la síntesis de proteoglucanos inhiben la acumulación de AMPc mediante un proceso mediado por calcio. Al contrario, las presiones intermitentes en los sistemas de cultivo de condrocitos resultan en aumentos tanto en la síntesis de AMPc como de proteoglucanos.
El efecto estimulante de las presiones hidrostáticas fisiológicas demostrado en el estudio coincide con lo hallado por otros autores. Algunos estudios sugieren que los condrocitos artrósicos serían más sensibles a la presión hidrostática que los normales. En los resultados presentados, sin embargo, el efecto estimulante de la presión no alcanzó para contrarrestar el efecto negativo del agregado de IL-1beta, que induce un desequilibrio metabólico y morfológico significativo.
Sin embargo, el agregado de AH aportó protección contra los efectos de IL-1beta bajo condiciones de presurización. El uso simultáneo de presurización en presencia de AH determinó un aumento sustancial en los niveles de proteoglucanos, compatible con un sinergismo entre la droga y el factor mecánico en relación con la IL-1beta. Los datos morfológicos respaldaron los bioquímicos.
El tratamiento con AH en los pacientes con artrosis de rodilla determina un incremento sustancial en el espesor del cartílago superficial con un aumento en la densidad de los condrocitos y una recuperación de las características estructurales relacionadas con el anabolismo.
Hallazgos recientes demostraron que el NO es un mediador potente en el daño del cartílago en la artrosis. Diversos estudios in vitro señalaron que el NO y sus productos pueden acelerar el catabolismo cartilaginoso y disminuir su metabolismo. Incluso, una inhibición selectiva de la sintasa inducible de NO puede reducir la progresión de la artrosis experimental in vivo.
Este estudio demostró que la IL-1beta aumenta significativamente la producción de NO y que el AH la disminuye. Bajo presurización, se detectó una producción algo menor de NO; y la presurización fisiológica disminuyó la síntesis de NO inducida por IL-1beta. Estos resultados confirman el efecto protector de la presión hidrostática cíclica sobre la liberación de NO por los condrocitos cuando son estimulados por otros factores. El agregado de AH aumentó considerablemente los efectos de la presión hidrostática.
El mecanismo de acción del AH no está cabalmente esclarecido. Algunas de sus acciones estarían mediadas por la unión con receptores específicos (CD 44, ICAM-1) expresados por diversas células, entre ellas las involucradas en la aparición de la artrosis, como las células inflamatorias, sinoviocitos y condrocitos.
Como conclusión, el estudio confirma la importancia de la presión hidrostática sobre el metabolismo de los condrocitos. El uso de condrocitos aislados en este estudio de respuesta metabólica a la carga debe interpretarse con cuidado, debido al importante papel de la matriz extracelular natural en la traducción y transmisión de las cargas externas a los componentes celulares e intracelulares. Los condrocitos cultivados sí pueden usarse para analizar el mecanismo mediante el cual tienen lugar los efectos de la presión sobre las células.
El estudio destaca el papel estimulante del AH sobre la producción de proteoglucanos y la activación metabólica de los condrocitos, así como el efecto inhibitorio sobre la síntesis de NO.
Los resultados confirman los datos in vitro obtenidos en estudios clínicos con pacientes con artrosis que informan una acción posiblemente modificadora a nivel estructural.
Los efectos del AH se exacerban in vitro mediante la presurización fisiológica; por ende, la eficacia farmacológica en el ser humano podría mejorarse con una actividad física adecuada.

Ref : TRAUMA, REUMATO, HYALART.

Especialidad: Bibliografía - Reumatología - Traumatología