Estudian Nuevos Métodos de Detección de Sensibilidad en Aislamientos Clínicos de Mycobacterium tuberculosis

• AUTOR : Mengatto L, Chiani Y, Imaz M
• TITULO ORIGINAL : Evaluation of Rapid Alternative Methods for Drug Susceptibility Testing in Clinical Isolates of Mycobacterium Ttuberculosis
• CITA : Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 101(5):535-542, Ago 2006
• MICRO : Evaluación de métodos nuevos y «caseros» de sensibilidad a drogas y comparación de su sensibilidad y especificidad con el método de referencia (Lowestein-Jensen).

 

En los últimos años se ha observado un aumento de cepas de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes que hacen necesaria la creación de nuevos métodos de diagnóstico rápidos y fiables junto con pruebas de sensibilidad a drogas (PSD). Los métodos recomendados en la actualidad para la identificación de micobacterias y susceptibilidad a drogas son el Lowestein-Jensen (LJ) y el método radiométrico BACTEC TB-460; sin embargo, son costosos y requieren mucho tiempo para su realización. Por esto se han desarrollado nuevos métodos comerciales rápidos, como el tubo indicador de crecimiento de micobacterias (MGIT [mycobacterial growth indicator tube]), cuya desventaja es su alto costo, que impide utilizarlo en países subdesarrollados. Además, se han descrito nuevas PSD. La PSD cuantificada por microscopio (MODS [microscopic observation susceptibility testing]) se basa en las características morfológicas de M. tuberculosis y el método de microdilución (BMM [microdilution method]) es rápido y práctico para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de las drogas antituberculosas. La asociación de este método con componentes colorimétricos, como el indicador de oxidación-reducción (MTT), se utiliza para mejorar la lectura de colonias de M. tuberculosis. Otro método es el que utiliza nitrato reductasa (NRA [nitrate reductase assay]), basado en la habilidad del M. tuberculosis en reducir nitrato a nitrito. Los autores compararon la fiabilidad entre el método comercial (MGIT) con 4 PSD económicas: MODS, BMM, MTT y NRA.

Materiales y métodos

Los autores recibieron 64 muestras de M. tuberculosis de distintos pacientes en el laboratorio del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias «E. Coni» (Santa Fe, Argentina) entre 2003 y 2005. Todas las muestras fueron sembradas en LJ y en forma ciega en los otros métodos. Las drogas antituberculosas utilizadas fueron rifampicina (RIF), isoniazida (INH), etambutol (EMB) y estreptomicina (EM). El medio de LJ fue utilizado como método de referencia. La MODS utilizó placas estériles donde se colocó el inóculo y las concentraciones respectivas de las drogas antituberculosas. Cada placa tenía un pocillo adicional libre de drogas y bacterias que servía de control para determinar la contaminación cruzada. Las placas se cubrieron y sellaron con bolsas plásticas e incubadas a 37º C en una atmósfera normal. A partir del tercer día y cada 2 días, los pocillos eran revisados con el microscopio de luz invertida en búsqueda de micobacterias. Los autores definieron como crecimiento a la emergencia de grupos serpenteantes de bacterias y establecieron como resistencia al crecimiento bacteriano en las placas con antibióticos, mientras que la ausencia de bacterias en estas placas indicaron indicó cepas sensibles.

El método comercial (MGIT) se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; se utilizaron 3 tubos: 1 de control y 2 con drogas antituberculosas. El método NRA cambia de color con el crecimiento micobacteriano, lo que indica resistencia bacteriana, por lo que la muestra se repitió en los días 10 y 14, respectivamente. El método MTT se efectuó de acuerdo con la descripción de Caviedes y colaboradores (2002), mientras que el BMM se basó en la CIM de cada droga y se definió como la menor concentración del fármaco que impidió el crecimiento bacteriano observado; las cepas se consideraban susceptibles a cada droga si la CIM era igual o inferior a los puntos de corte actuales. Todos los métodos fueron comparados con el MGIT en términos de sensibilidad (habilidad de detectar resistencia verdadera) y especificidad (capacidad de detectar verdadera susceptibilidad).

Resultados

El 40% de las muestras fue resistente a INH, 39% a RIF, 30% a EM y 13% a EM. Veintinueve de los cultivos fueron sensibles a todas las drogas, 7 fueron resistentes a una de ellas, 16 lo fueron a 2 drogas y 9 cultivos a 3. Los autores compararon los resultados de los 4 métodos económicos con el método de referencia.

Resultados de las pruebas de sensibilidad

INH. En relación con los cultivos sensibles, sólo los métodos MGIT y MODS0.1 m g/ml identificaron como resistente 1 de los 38 cultivos sensibles. De los 26 cultivos resistentes, 3 fueron susceptibles con MODS0.4m g/ml. Las pruebas con NRA, MTT y BNM no detectaron 2, una y 3 cepas resistentes, respectivamente. La sensibilidad del MGIT, NRA, MODS0.4m g/ml, MODS0.1 m g/ml, MTT y BMM fue del 100%, 92%, 88%, 100%, 96% y 88%, en igual orden, con una especificidad del 97%, 100%, 100%, 97%, 100% y 100%, respectivamente.

RIF. Todos los métodos económicos mostraron iguales valores en la sensibilidad y especificidad que los hallados en el método de referencia.

EMB. Se compararon los resultados del método de referencia con los resultados de NRA, MODS3,75m g/ml, MODS2,75m g/ml, MTT y BMM; en todos los casos, la especificidad fue alta y la sensibilidad, reducida.

EM. Los autores compararon los resultados del método de referencia con los obtenidos por NRA, MODS6m g/l, MODS2m g/ml, MTT y BMM. Sólo los 2 últimos identificaron 3 y 2 cultivos, respectivamente, resistentes y sensibles. La sensibilidad global de los métodos NRA, MODS6m g/l, MODS2m g/ml, MTT y BMM fue de 84%, 68%, 89%, 95% y 100%, respectivamente, mientras que la especificidad fue del 100%, 100%, 100%, 93% y 96%, en igual orden. El tiempo hasta la obtención del resultado promedio requerido para obtener la sensibilidad por los métodos de MGIT, NRA, MODS y MTT fue de 6.4, 9, 7 y 7.7 días, respectivamente.

Discusión

Actualmente existen métodos nuevos y rápidos para evaluar la sensibilidad a drogas de M. tuberculosis (MGIT, NRA, MODS, MTT y BMM). Si bien varían considerablemente en el medio y la concentración de drogas que utilizan, han sido probados con eficacia en el pasado. Los autores no encontraron estudios comparativos entre estos métodos, por lo que en este trabajo comparan su eficiencia. Según el presente estudio, todos los métodos evaluados tienen un excelente rendimiento para INH y RIF (valores de sensibilidad y especificidad mayores del 90%), aunque observaron algunas discrepancias con las otras drogas de primera línea (EMB y EM). Los factores que pueden haber contribuido en esta diferencia abarcaron la baja proporción de organismos resistentes en el cultivo, las diferencias en los medios de cultivos utilizados por los distintos métodos y los diferentes períodos de incubación. La mayoría de las discrepancias de sensibilidad o especificidad observadas entre el método de referencia y los MTT o BMM fueron de los aislamientos con CIM, con una dilución más alta o más baja del valor de corte. Para estos casos, algunos autores proponen 3 categorías de susceptibilidad: susceptible, parcialmente resistente y resistente.

El uso de la doble concentración crítica de drogas antituberculosas con la MODS permitió identificar el 11% de las cepas resistentes a INH y el 21% de las cepas resistentes a EM, que correspondería a una cepa parcialmente resistente según el método de MTT. El 25% de las cepas resistentes fueron identificadas como sensibles por el método de NRA. Debe destacarse que éstas fueron las únicas del total de cepas resistentes que tuvieron la menor proporción de bacterias resistentes según el método de referencia (LJ).

El tiempo hasta la obtención del resultado es importante para que el paciente pueda recibir el tratamiento apropiado. El MGIT, la MODS y los métodos por NRA y MTT tuvieron un promedio menor a 10 días en comparación con el método de referencia (BACTEC-460), mientras que el método BMM, aunque demandó más tiempo (20 días), fue más rápido que el LJ (28 a 40 días).

Los autores notaron una completa concordancia en los resultados de sensibilidad para RIF entre todos los métodos evaluados, factor muy importante en los países con alta endemia, dado que la resistencia a RIF se considera un fuerte predictor de la presencia de tuberculosis multirresistente.

Según esta investigación, el método MGIT es confiable, rápido y conveniente para realizar la susceptibilidad a INH y RIF; sin embargo, su costo elevado imposibilita su empleo en países subdesarrollados. Los autores demostraron que los distintos «métodos caseros» son útiles en la detección rápida de la sensibilidad antibiótica y muestran un buen nivel de correlación respecto de los resultados obtenidos con el método de referencia. El método NRA es el más económico, aunque sólo brinda resultados cualitativos. Por su parte, los métodos MTT y BMM pueden identificar resistencia parcial pero tienen la desventaja de ser peligrosos en cuanto a la bioseguridad, dado que la manipulación de las placas puede generar aerosoles; esta desventaja puede mejorarse al colocar las placas en bolsas plásticas correctamente aseguradas. A diferencia del método MTT, la MODS y el BMM no necesitan reactivos adicionales y evitan la manipulación de las placas.

Especialidad: Bibliografía - Infectología