Evaluación Molecular de la Vaginosis Bacteriana

• TITULO : Evaluación Molecular de la Vaginosis Bacteriana
• AUTOR : Dols J, Molenaar D, Kort R y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Molecular Assessment of Bacterial Vaginosis by Lactobacillus Abundance and Species Diversity
• CITA : BMC Infectious Diseases 16(180), Abr 2016
• MICRO : La evaluación molecular de la diversidad de especies mediante la secuenciación de ARN ribosomal 16S y la abundancia de lactobacilos son marcadores adecuados para estimar la presencia, o no, de vaginosis bacteriana.

Introducción

Se denomina vaginosis bacteriana (VB) a la alteración de la microbiota vaginal, con depleción de lactobacilos y mayor diversidad de la población bacteriana, además de un valor de pH más elevado. Es uno de los síndromes vaginales más frecuentes en mujeres fértiles, premenopáusicas y embarazadas. Muchas veces, cursa con olor, lo que motiva la consulta al médico, si bien en otras ocasiones no se asocia con este signo u otros síntomas.

El diagnóstico correcto es importante porque la VB se asoció con partos pretérmino y mayor riesgo de infecciones de transmisión sexual (ITS). LA VB tiene altas tasas de fracaso del tratamiento y de recidiva. Clásicamente el diagnóstico de la VB se basa en los criterios de Amsel y el puntaje de Nugent, pero estos tienen baja especificidad para la detección de Gardnerella vaginalis y alta variación entre los observadores cuando las muestras se evalúan en el microscopio. Las tecnologías de secuenciación de última generación (NGS [next generation sequencing]) permiten la detección de secuencias conocidas, o no, sobre la especie presente en la muestra, lo que permite analizar la diversidad de la comunidad microbiana. Los estudios de microarray (chips de ácido desoxirribonucleico [ADN]) requieren la selección previa de los organismos que se buscarán en la muestra, y puede producirse hibridación cruzada entre secuencias similares; sin embargo, se ha informado que este método es útil para la detección de organismos relacionados con la VB, incluso similar a la de NGS. Un tercer método, aún no evaluado en este contexto, es la identificación de perfiles de los espacios entre los genes 16S y 23S de ácido ribonucleico ribosomal (ARNr), denominado IS-profiling.

El objetivo del presente estudio fue analizar los resultados de la secuenciación de amplicones de ARNr 16S de la microbiota vaginal de mujeres con resultados positivos o negativos en el puntaje de Nugent y comparar los distintos métodos nuevos de identificación.

Métodos

Se incluyeron mujeres mayores de 18 años, con signos o síntomas vaginales que sugirieran ITS o aquellas con parejas con alguna de estas infecciones. Se realizó examen físico cervical y la toma de muestras mediante hisopos para la determinación de rutina de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. Se determinó, además, la presencia de otras ITS: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), sífilis, hepatitis B, herpes 1 y 2, Trichomonas, Moluscum contagiosum, sarna, enfermedad inflamatoria pélvica y úlceras genitales. Se estudió la microbiota vaginal de 40 mujeres (la mitad con resultados positivos para VB, determinados por puntajes altos, de 7 a 10, en la escala de Nugent), se determinó la presencia de candidiasis vulvovaginal y se usaron los criterios de Amsel. El pH no se midió.

Se aisló ADN de las muestras mediante métodos estandarizados y se utilizaron secuenciadores de NGS y reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa para el gen del ARNr 16S. Así se generaron 2745 (entre 96 y 5932) copias de la secuencia, con una única muestra, sin copias suficientes para el análisis (fue excluido por esta causa). También se determinaron las especies presentes mediante la comparación de las secuencias identificadas y las bases de datos sobre el tema.

Para el análisis estadístico se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson y la prueba de Kruskal-Wallis. Además, se realizó una prueba de chips de ADN de distintas especies bacterianas, presentes habitualmente en la VB, y en 15 muestras se amplificaron regiones específicas para el IS-profiling, que puede detectar Firmicutes, Actinobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes y Proteobacteria. El índice de Gini-Simpson se utilizó para calcular la abundancia relativa de las secuencias y la clasificación de la muestra.

Resultados

Según los criterios de Amsel, 21 mujeres tuvieron resultados positivos para VB, con un único caso con discrepancia en comparación con el método de Nugent (gran abundancia de G. vaginalis). En 2 pacientes se identificó candidiasis vulvovaginal y en 10, ITS (especialmente, Chlamydia), sin casos del VIH, sífilis, gonorrea, hepatitis B, M. contagiosum, sarna, enfermedad inflamatoria pélvica o úlceras genitales.

La secuenciación de ARNr 16S relevó 5 (I a V) grupos diferentes de bacterias (en uno habría dos subgrupos), de los cuales 3 estaban presentes en mujeres con resultados positivos para VB y 2 en las muestras negativas. En este último grupo, la diversidad de las especies fue relativamente baja, con mayor presencia de Lactobacillus iners o crispatus. L. iners dominó el grupo I (81% de la muestra), mientras que en el grupo II hubo predominancia de L. crispatus (con 79% de representación contra 17% de L. iners) y correlación negativa entre estas dos especies. En el perfil de la microbiota del grupo III (5 mujeres) dominó G. vaginalis, que representó el 43% de la muestra, y Leptotrichia amnionii (12% de la muestra). En el grupo IV se identificó abundancia de la familia Lachnospiraceae, que representó el 52% de la muestra. El grupo V tuvo alta diversidad de la microbiota, con presencia de Sneathia sanguinegens y G. vaginalis en el 22% y 15% de la muestra, respectivamente. Solo en el 37% de las mujeres con VB se halló deficiencia de L. crispatus. Se detectó una correlación fuerte entre la abundancia de las secuencias y el puntaje de Nugent para las secuencias de bacterias ácidas no lácticas (Coriobacteriaceae, Leptotrichiaceae y Veillonellaceae). La presencia de secuencias de la familia Coriobacteriaceae fue un factor de gran discriminación entre los grupos. No se detectó correlación entre la abundancia de las secuencias y otras variables clínicas, como la edad, la presencia de ITS o candidiasis o los signos y los síntomas de las pacientes.

En el estudio de chips de ADN se observó mayor presencia de Firmicutes (especialmente, Lactobacillaceae) en las muestras de mujeres con resultados negativos en comparación con aquellas positivas para VB, mientras que en estas últimas se verificó abundancia de Bacteroidetes. En el grupo II se confirmó la abundancia de L. crispatus, y en el grupo IV, de Lachnospiraceae, pero no fue posible identificar por separado el grupo III. El uso de IS-profiling reveló gran diversidad de Firmicutes (incluidos Lachnospiraceae y Lactobacillaceae) en las muestras positivas, y mayor diversidad (especialmente, en el grupo IV) en estas muestras en comparación con aquellas con resultados negativos para VB. También se compararon diversos marcadores moleculares para la determinación de VB y se observó buen poder de discriminación de la diversidad bacteriana mediante la secuenciación de ARNr 16S, pero no cuando se usaron chips de ADN o IS-profiling, que sobreestiman la diversidad. Además, la secuenciación de ARNr 16S es un método útil para estimar la dominancia de Lactobacillus, que pudo calcularse adecuadamente con otros métodos. Se sugirió que la presencia de L. crispatus sería el mejor indicador de ausencia de VB, puesto que esta bacteria estuvo ausente en todas las muestras (hallazgo confirmado mediante los tres métodos), pero su ausencia no sería indicativa de la enfermedad, puesto que esta bacteria no se detectó en el grupo I. La dominancia de L. iners también parece otro buen indicador de ausencia de vaginosis, si bien en estudios previos se halló que podría estar presente en esta infección (solo en un caso se verificó en el 32% de la muestra).

Discusión y conclusiones

En el presente estudio se observó que, en mujeres con resultados negativos para VB, hay dos grupos de bacterias vaginales: uno dominado por L. iners y otro, por L. crispatus, además de tres grupos diferentes en las pacientes con resultados positivos. La diversidad de las especies fue relativamente alta en las muestras positivas, con dominancia de varias especies de anaerobios. Esta diversidad, evaluada mediante el índice de Gini-Simpson, y la abundancia relativa de las especies de Lactobacillus parecen los mejores indicadores de VB. La secuenciación de ARNr 16S sería el mejor método para estimar la diversidad de especies, mientras que los criterios de Amsel, el puntaje de Nugent y el IS-profiling fueron adecuados para indicar la abundancia de lactobacilos.

Los autores concluyen que la evaluación molecular de la diversidad de especies y la abundancia de lactobacilos son marcadores moleculares adecuados para estimar la presencia, o no, de VB.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología