Evalúan la Sensibilidad a los Antibióticos de los Aislamientos Clínicos de cepas de Haemophilus influenzae con Resistencia a los Beta Lactámicos

• AUTOR : Hirakata Y, Ohmori K, Kaku M y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Antimicrobial Activities of Piperacillin-Tazobactam Against Haemophilus Influenzae Isolates, Including Beta-Lactamase-Negative Ampicillin-Resistant and Beta-Lactamase-Positive Amoxicillin Clavulanate-Resistant Isolates and Mutations in TheirQuinolone Resistance-Determining Regions
• CITA : Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53(10):4225-4230, Oct 2009
• MICRO : Los autores evaluaron la actividad de la combinación piperacilina-tazobactam frente a aislamientos de Haemophilus influenzae, incluyendo cultivos negativos para beta lactamasas resistentes a ampicilina y positivos para beta lactamasas resistentes a amoxicilina-ácido clavulánico, y las mutaciones en las regiones determinantes de la resistencia a las quinolonas.

Introducción

Haemophilus influenzae es una de las causas más comunes de infecciones del tracto respiratorio inferior adquiridas en la comunidad y de enfermedad invasiva, incluyendo bacteriemia y meningitis. En los años setenta en Estados Unidos, se informó sobre el primer aislamiento de H. influenzae positivo para beta lactamasas y resistente a la ampicilina (PBLRA) y sobre el primer cultivo del mismo germen negativo para beta lactamasas resistente a la ampicilina (NBLRA) en 1980. Si bien la frecuencia de los cultivos NBLRA de H. influenzae es baja en Estados Unidos y permaneció relativamente constante en las vigilancias longitudinales en Europa, han surgido aislamientos de este tipo en países como Japón, España y Corea. En 1997, se encontraron cultivos de H. influenzae positivos para beta lactamasas y resistentes a amoxicilina-clavulánico (PBLRAC) en Estados Unidos. De esta forma, los aislamientos clínicos de H. influenzae pueden dividirse en cuatro tipos, según la producción de beta-lactamasa y la resistencia: negativos para beta lactamasas y susceptibles a ampicilina (NBLSA), PBLRA, NBLRA y PBLRAC.

Los datos sobre las susceptibilidades in vitro a los beta-lactámicos, incluso piperacilina-tazobactam, no son suficientes según los autores para los aislamientos de H. influenzae, especialmente en el caso de los NBLRA y PBLRAC. Entre 1990 y 1995, el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) estableció los puntos de corte de susceptibilidad de H. influenzae, especialmente a las penicilinas, para delinear los cultivos positivos para beta lactamasas. Si bien la CLSI tiene puntos de corte de sensibilidad probados para múltiples agentes, respecto de piperacilina-tazobactam tiene solo un punto de corte de la concentración inhibitoria mínima (CIM) (< 1 µg/ml) y señala que H. influenzae NBLRA debe considerarse resistente independientemente de los resultados de la CIM, a pesar del hecho de que la piperacilina por sí sola es muy activa contra este cultivo.

Aun más, se informaron aislamientos ocasionales de H. influenzae con resistencia a las fluoroquinolonas. Algunos autores reportaron recientemente que este tipo de resistencia estuvo surgiendo en los adultos mayores en Japón, con algunos aislamientos que presentaron CIM para levofloxacina de 16 µg/ml o más.

El objetivo del presente estudio fue evaluar las susceptibilidades a los beta-lactámicos, como piperacilina-tazobactam, y a ciprofloxacina de un total de 400 aislamientos clínicos recientes de H. influenzae recolectados a lo largo de Japón, que consistieron en 100 de cada grupo de NBLSA, PBLRA, NBLRA y PBLRAC. También se determinaron las mutaciones existentes en algunos de los aislamientos resistentes a la ampicilina y las mutaciones en las regiones determinantes de resistencia a las quinolonas (RDRQ).

Métodos

Para el estudio inicial se usó un total de 400 aislamientos clínicos recientes de H. influenzae proveniente de 138 hospitales y clínicas de Japón y se estudiaron de forma consecutiva sin repetición de los pacientes. En el estudio adicional, se emplearon 50 aislamientos clínicos del mismo microorganismo, pero con bajas CIM para ciprofloxacina (< 0.03 µg/ml). Los cultivos de H. influenzae se identificaron y confirmaron por la morfología de las colonias, la tinción de Gram, el crecimiento en agar chocolate, la prueba de catalasa y los requerimientos de factor X y V.

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos se realizaron tanto por el método de microdilución como por el método de difusión en disco. Las CIM se determinaron mediante los métodos de referencia del CLSI para la microdilución, con medios de prueba de Haemophilus para ampicilina, ampicilina-sulbactam, amoxicilina-clavulánico, piperacilina, piperacilina-tazobactam, ceftriaxona, imipenem, meropenem y un control no beta lactámico, ciprofloxacina. Se utilizaron dos cultivos de H. influenzae (uno NBLSA y el otro NBLRA) como controles de calidad para ambos métodos.

Los aislamientos que presentaron CIM altas (intermedia [2 µg/ml] o que resultaron resistentes [> 4 µg/ml]), pero que fueron negativos para beta lactamasas, se clasificaron como NBLRA, mientras que los que producían beta lactamasas y eran resistentes a amoxicilina-clavulánico se definieron como PBLRAC.

Para determinar las mutaciones asociadas con resistencia en los fenotipos NBLRA y PBLRAC se utilizó PCR con cebadores que amplificaron regiones específicas del gen ftsI. También se determinaron las secuencias de nucleótidos de los RDRQ de los genes gyrA, gyrB, parC y parW.

Resultados

Por un lado, todos los beta lactámicos y la ciprofloxacina presentaron una muy alta actividad antimicrobiana contra los aislamientos NBLSA. Por otro lado, en el caso de los PBLRA, mientras la combinación amoxicilina-clavulánico fue activa contra todos los aislamientos, la sensibilidad a la ampicilina-sulbactam fue del 75%. La piperacilina sola no fue activa, mientras que la piperacilina-tazobactam fue altamente efectiva. Si bien los intervalos de CIM de ceftriaxona y meropenem fueron ligeramente mayores que para los NBLSA, sus sensibilidades permanecieron en el 100%. Uno de los aislamientos fue resistente al imipenem.

En el caso de los cultivos NBLRA, la ampicilina-sulbactam, amoxicilina-clavulánico y ampicilina no fueron lo suficientemente activos, mientras que la piperacilina y piperacilina-tazobactam retuvieron una actividad importante. Los intervalos de CIM para ceftriaxona, imipenem y meropenem fueron mayores que los de los aislamientos NBLSA y PBLRA; cuatro cultivos fueron resistentes al imipenem y uno al meropenem. El orden de potencia de los beta lactámicos para los aislamientos NBLRA fueron: piperacilina-tazobactam > piperacilina = ceftriaxona > meropenem > imipenem.

En el caso de H. influenzae PBLRAC, no hubo actividad por parte de ampicilina, piperacilina, ampicilina-sulbactam y amoxicilina-clavulánico, mientras que piperacilina-tazobactam retuvo una fuerte actividad. Dos aislamientos fueron resistentes al imipenem. El orden de potencia de los beta lactámicos fue: piperacilina-tazobactam = ceftriaxona > meropenem > imipenem.

Mientras que la ciprofloxacina fue siempre muy activa contra los cultivos NBLSA, PBLRA y NBLRA, un aislamiento PBLRAC fue completamente resistente a este antibiótico.

Respecto del método de la difusión en disco, si bien los fenotipos de H. influenzae incluyeron PBLRA y PBLRAC, los intervalos de control de piperacilina-tazobactam fueron de < 0.03 a 0.5 µg/ml y todas las zonas a > 21 mm se consideraron como indicadoras de alto grado de susceptibilidad.

Todos los cultivos NBLRA y PBLRAC presentaron sustituciones de aminoácidos en su gen ftsI, correspondiente a tres patrones diferentes de mutación. Los autores se basaron en las clasificaciones del grupo NBLRA propuestas por otros investigadores, y definieron que en el 100% de los aislamientos mencionados hubo mutaciones del motivo Lys-Thr-Gly, incluyendo Asn526 por Lys y Arg517 por His, análogos de los grupos originales IIa y I, respectivamente. Sin embargo, ninguno pudo clasificar como grupo I, ya que todas las cepas con mutaciones Arg517 por His también presentaron una mutación adicional de Ser385 por Thr en el motivo Ser-Ser-Asn, lo cual lo definió como parte del grupo III. De esta forma, el patrón más común (88.5%) pareció ser el grupo similar al III, mientras que los grupos I y IIa fueron responsables del 0% y 11.5%, respectivamente.

En cuanto a las mutaciones de las RDRQ, se examinaron primero los aislamientos con una CIM para ciprofloxacina de 0.25 µg/ml o más, pero tales cultivos tuvieron al menos una mutación en esas regiones. Por lo tanto, se amplió la evaluación para incluir a los que tenían una CIM de 0.06 µg/ml o más. De estos 37 aislamientos, 32 tenían cambios de aminoácidos en al menos una de sus RDRQ en gyrA, gyrB, parC y parE. La frecuencia de reducciones en la CIM de ciprofloxacina asociada con mutaciones en las RDRQ fue más evidente para los cultivos PBLRAC, ya que el más resistente de ellos, con una CIM de 16 µg/ml, presentó cinco cambios de aminoácidos en sus RDRQ, incluso en los genes mencionados previamente.

Discusión

Dentro de los beta lactámicos, la combinación piperacilina-tazobactam demostró claramente una actividad muy fuerte frente a todas las clases de aislamientos de H. influenzae. Un total de 400 aislamientos, incluyendo cuatro fenotipos distintos, fueron susceptibles de acuerdo con el punto de corte del CLSI, que advierte en diversas tablas presentes en sus documentos sobre la existencia de resistencia a algunos compuestos beta lactámicos; muchas de estas aseveraciones han estado presentes desde los años noventa. Los datos actuales se presentaron para estimular la reevaluación de los puntos de corte de H. influenzae en tiempos de una escalada de problemas a nivel mundial relacionados con los aislamientos NBLRA y PBLRAC. Este asunto parece ser de mayor magnitud en Asia y Europa Occidental, pero podría estar subestimado en otras regiones. Se demostró la alta potencia de la asociación piperacilina-tazobactam frente a estas cepas y los autores sugieren que se asignen puntos de corte precisos de susceptibilidad, aunque existen reportes de resistencia en las tablas del CLSI.

Este trabajo también confirmó que todos los cultivos NBLRA y PBLRAC presentaron sustituciones de aminoácidos en los productos genéticos de ftsI y que el patrón principal (87.5%) fue similar al grupo III, seguido de los aislamientos pertenecientes al grupo IIa.

Incluso, se encontró que muchos cultivos susceptibles a la ciprofloxacina tuvieron mutaciones en sus RDRQ, particularmente en el caso de los aislamientos PBLRAC, y que uno que era resistente presentó cinco mutaciones en esas regiones. Las mutaciones Ser84Ile y Ser84Arg en ParC y Ser84Leu y Asp88Asn en GyrA ya habían sido reconocidas por su asociación con resistencia a las quinolonas en H. influenzae. Estudios previos encontraron la mutación Asn138Ser en ParC en cepas susceptibles y sugirieron que no contribuye a la resistencia a las quinolonas, si bien podría ser que sea la primera de un patrón escalonado de mutaciones. Por lo tanto, no queda claro para los autores si todas las mutaciones en las RDRQ encontradas en el estudio contribuyen a la menor susceptibilidad a la ciprofloxacina. Sin embargo, dado que la CIM de este antibiótico para la mayoría de los aislamientos clínicos suele ser < 0.03 µg/ml, la de los cultivos asociados con estas mutaciones parece ser mayor. Teniendo en cuenta que los que presentaron CIM más altas para ciprofloxacina tendieron a presentar varias mutaciones en sus RDRQ, es posible que muchas cepas hayan tenido al principio mutaciones silentes y que luego adquieran una resistencia total a las quinolonas mediante una mutación escalonada de esas regiones, como se ha descripto en otros estudios en el caso de Streptococcus pneumoniae.

Conclusiones

Los autores concluyen señalando que la piperacilina-tazobactam fue el beta lactámico que más actividad presentó frente a todos los aislamientos de H. influenzae, incluyendo los NBLSA, PBLRA, NBLRA y PBLRAC, con todas las CIM iguales o menores de 0.5 µg/ml. Se propuso que los puntos de corte de sensibilidad en la difusión en disco sea > 21 mm. Es posible que emerjan cepas resistentes a las quinolonas, ya que varios aislamientos clínicos con CIM altas para ciprofloxacina presentaron mutaciones específicas en sus RDRQ, mientras que otros con CIM bajas tuvieron mutaciones en las mismas regiones, las cuales no contribuyen a la resistencia del germen a la ciprofloxacina. La determinación aislada de beta lactamasas se realiza en los cultivos de H. influenzae, y muchos laboratorios no determinan de forma precisa las susceptibilidades al antimicrobiano. Esto podría implicar una falta de detección de NBLRA, PBLRAC y asilamientos con resistencia silente a las quinolonas. Los autores proponen que se realicen pruebas de sensibilidad para evitar la subestimación de la frecuencia de estas cepas resistentes emergentes.

Ref : INFECTO, FARMA, BAGOTAZ.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología - Infectología