La Compresión Asimétrica Provoca Deformaciones Estructurales y Daños a Nivel Celular sobre los Discos Intervertebrales en un Modelo in Vitro

• AUTOR : Walter BA, Korecki CL, Iatridis JC y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Complex Loading Affects Intervertebral Disc Mechanics and Biology
• CITA : Osteoarthritis and Cartilage 19(8):1011-1018, Ago 2011
• MICRO : Una carga moderada aplicada con una inclinación de 15 grados demostró provocar deformaciones estructurales, apoptosis celular y respuesta inflamatoria en discos intervertebrales bovinos en preparados de cultivo.

Introducción

Es sabido que los factores mecánicos influencian la respuesta biológica de los discos intervertebrales (DIV) y provocan cambios en la actividad metabólica e integridad de la matriz. Se ha sugerido que existe una capacidad de carga máxima que, al ser superada, provoca daños estructurales y la remodelación catabólica. Sin embargo, no se sabe cuán dependiente es el daño estructural de la magnitud y el modo de la carga.

Las grandes cargas (de hasta 2.5 MPa) parecen aumentar el metabolismo de los DIV. La combinación de varios modos de carga, o las cargas complejas, conlleva movimientos espinales, como la flexión y la compresión. La hiperflexión ha sido involucrada en el daño a los DIV por las fuertes distensiones más los daños de compresión axial. No obstante, se ha encontrado que las cargas complejas, pero menos extremas, también provocaron daños e insuficiencias en un modelo que combinó torsión axial con fatiga por extensión y flexión en segmentos porcinos.

Las evaluaciones biomecánicas de cargas extremas en los DIV determinaron que pueden llevar a hernias u otras patologías. Se necesita entender la interacción entre los factores biológicos y biomecánicos para restaurar la función de los DIV y prevenir su degeneración progresiva.

Los estudios en animales pequeños demostraron que la flexión forzada provoca cambios en la organización anular y reducción de la expresión de genes anabólicos específicos. Sin embargo, la respuesta biomecánica del tejido de los DIV a la flexión forzada no es concluyente, por lo que realizar medidas adicionales de la respuesta catabólica correspondiente podría ayudar a caracterizar los efectos de la carga en el metabolismo celular.

También, se han documentado cambios en la actividad celular, la enzimática y en la morfología anular de los DIV en sujetos a compresión y flexión, tanto en modelos de animales o escoliosis. Pero la contribución de cargas complejas a estos cambios estructurales es difícil de cuantificar en modelos de animales pequeños y de separar de procesos de la enfermedad en modelos de escoliosis.

Uno de los problemas que podría surgir por las cargas complejas es el inicio de respuestas inflamatorias por estrés anormal de los tejidos. Ya que las citoquinas inflamatorias pueden ser expresadas de manera local por los DIV, existe la posibilidad de que tenga lugar una respuesta inflamatoria localizada.

El objetivo de este estudio fue evaluar las respuestas mecánica y biológica temprana en un modelo de explantes de DIV frente a las cargas complejas. 

Métodos

Se aislaron 32 DIV a partir de 12 colas de bovinos y se asignaron de manera equilibrada a dos grupos: control (C) y cuña (W). Se promediaron los resultados de los DIV provenientes de la misma cola. Las disecciones se realizaron en esterilidad y los DIV fueron lavados con soluciones de etanol, antibióticos y fungicidas en solución amortiguadora con fosfatos y se cultivaron por 7 días. Inicialmente, se utilizó una carga estática de 0.2 MPa. Los especímenes del grupo W fueron cultivados en una cámara modificada que aplicó la carga a un ángulo de 15 grados.

La altura y el diámetro de los DIV fueron medidos al inicio y al final del cultivo. Se recolectó el medio de cultivo a los días 4 y 7, y se analizó el contenido de glucosaminoglucano (GAG). Se determinaron los niveles de proteína del agrecano, los niveles de agua y la estructura del tejido del anillo fibroso (AF). Las muestras de tejido se extrajeron de las secciones cóncavas y convexas de los DIV del grupo W (determinadas de acuerdo con la curvatura de la flexión simulada por la carga). Los DIV del grupo C también se dividieron en dos mitades. Se evaluó el módulo agregado (Ha) mediante aproximación lineal de las curvas de equilibrio de tensión-deformación, y la tasa tensión máxima/tensión en equilibrio (M/E), utilizando una tensión del 15%. Se estudió la expresión génica mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa a partir de ARN extraído de los tejidos de los AF y de los núcleos pulposos (NP). También, se evaluaron los niveles de viabilidad celular, mediante tinciones dobles con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, que tiñe células viables, y 4,6-diamidino-2-fenilindol, que tiñe todas las células. Los niveles de apoptosis se determinaron mediante técnicas de inmunofluorescencia para la caspasa-3.

Para los análisis estadísticos se realizaron pruebas de ANOVA de medidas repetidas y de una vía y pruebas de la t pareadas y no pareadas, según fue necesario. Las comparaciones post hoc se realizaron con pruebas de Tukey. Los datos se mencionan como promedio (intervalos de confianza del 95%). Los valores de p menores de 0.05 fueron considerados significativos.

Resultados

La distribución de la tensión en los DIV del grupo C fue uniforme (cerca de 0.23 MPa), mientras que en el grupo W se registró una tensión axial de hasta 0.45 MPa en regiones del AF cóncavas y cercanas o menores de 0.23 MPa en las regiones convexas. Las porciones cóncavas del AF mostraron un Ha significativamente mayor al de las porciones convexas (1.708 [0.464-2.951] MPa y 0.334 [0.182-0.487] MPa, respectivamente; p = 0.033), pero no llegaron a ser significativamente mayores al valor de los controles (1.098 [0.521-1.676] MPa). La tasa M/E fue mayor en las regiones convexas de los DIV del grupo W que en las regiones cóncavas (4.418 [2.155-6.680] y 2.342 [1.537-3.147]; p = 0.013). Ninguna región se diferenció de los valores del grupo C (3.449 [3.102-3.797]).

El contenido de agua de los DIV del grupo W fue mayor en el lado convexo que en el cóncavo y que el de los DIV control (68.9% [66.7-71.1%], 64.8% [62.8-66.7%] y 63.8% [60.7-66.8%], respectivamente; p = 0.0016). El cambio en los diámetros fue similar en ambos grupos. La altura de los DIV control disminuyó un 38.1% (31.1-45.1%), la del lado cóncavo de los DIV del grupo W disminuyó un 74.1% (70.2-78.1%) y los del lado convexo, un 5.4% (4.5-aumento del 15.4%). Las diferencias fueron significativas respecto del grupo C (p < 0.0001). No hubo diferencias en el contenido de GAG en ningún momento. El contenido de proteínas analizado por western blot del agrecano resultó menor en el lado cóncavo del grupo W. El lado convexo no mostró diferencias con el grupo C. Se observaron modificaciones del AF y migración del NP en los DIV del grupo W. Las mitades cóncavas presentaron plegado de las láminas, mientras que, en las convexas, se observó un aparente incremento en la tinción del proteoglucano.

La expresión génica en los NP no se diferenció entre los grupos. Se verificó un mayor nivel de ARN de los genes catabólicos MMP-1 y ADAMTS4, y de los genes de citoquinas proinflamatorias interleuquina (IL) 1beta e IL-6 en los AF convexos del grupo W respecto de los valores control. Al comparar la expresión génica entre regiones de los DIV del grupo W, se observó una mayor expresión de genes catabólicos en las regiones convexas que en las cóncavas.

La viabilidad en los AF de los DIV control fue homogénea entre mitades y del 83.8% (71.6-95.5%). En el grupo W se notó una disparidad en la tinción de células vivas (mitades cóncavas: 13.2% [0-57.1%]; mitades convexas: 77.6% [18.0-100%]; p = 0.005). Las mediciones de caspasa-3 mostraron ser mayores en las regiones cóncavas que en las convexas y en el grupo C. No se encontraron diferencias en los NP. 

Discusión

Este estudio encontró que la compresión asimétrica provocó daños en el tejido de los DIV. A nivel celular, se halló una disminución de células viables por apoptosis en la región cóncava y aumento en la expresión de genes catabólicos y de citoquinas proinflamatorias en la región convexa. A nivel del tejido, se encontraron daños evidentes en la histología, compactación del tejido, disminución de las respuestas viscoelásticas y pérdida del agrecano.

La remoción de los platillos terminales fue necesaria para mantener la viabilidad celular en el medio de cultivo. Otro estudio realizado con remoción de los platillos terminales que utilizó una compresión dinámica de hasta 2.5 MPa presentó un incremento en la biosíntesis sin daños estructurales o muerte celular. Al comparar ambos estudios se puede inferir que la compresión asimétrica tiene un efecto deletéreo, mientras que la compresión dinámica se aproxima más a las condiciones saludables de carga. El ángulo de carga aplicado fue similar al encontrado en pacientes con escoliosis. Sin embargo, los cambios en la altura encontrados, tanto en el grupo W como en el grupo C, fueron mayores a los esperados de acuerdo con la situación in vivo. Esto puede deberse a un abultamiento generado por la remoción de los platillos terminales y la relajación muscular e inflamación post mortem, previas al cultivo.

La disminución en la viabilidad es consistente con los hallazgos en tejido escoliótico, en los que se midieron niveles menores de ADN en la región cóncava del AF. El aumento de los niveles de caspasa-3 sugiere que la muerte celular observada fue mediada por procesos de apoptosis y no por necrosis. La compresión asimétrica también provocó una respuesta inflamatoria con aumento del ARNm de citoquinas proinflamatorias en la región convexa del AF. No se detectó incremento del factor de necrosis tumoral (TNF) alfa. Esto puede deberse a que el TNF-alfa está involucrado en el inicio de la respuesta inflamatoria, mientras que la medición de la expresión génica se realizó luego de 7 días.

El incremento en el Ha de la región cóncava sugiere una disminución en la permeabilidad. Sin embargo, se observó lo opuesto, al ser menor la tasa M/E. Se sugiere, entonces, que el daño estructural puede incrementar el transporte de agua. Esto puede deberse a que los microtúbulos paralelos a la dirección de compactación se extienden por un efecto de Poisson, que podría ser consistente con lo encontrado en la histología, donde los AF se compactaron en el eje y se ensancharon lateralmente (verificado por el cambio de posición del NP). Además, la posibilidad de un aumento en el transporte de agua en la región cóncava sugiere que no hubo compromiso nutricional que llevara a la muerte celular por apoptosis. En el lado convexo, el aumento en el Ha observado es consistente con el incremento en el contenido de agua. El aumento en la tasa M/E sugiere un transporte reducido de agua, que puede estar asociado con el incremento en el GAG debido a la migración del NP, según lo informado en la bibliografía sobre escoliosis.

Conclusión

Se investigaron los efectos de una carga compleja que consiste en la compresión axial a un ángulo de 15 grados en un modelo de cultivo de animal de gran porte. Aun al ser una fuerza de baja magnitud, indujo la muerte celular, daños estructurales, aumentos en el ARNm de genes catabólicos y de citoquinas proinflamatorias. Todo esto sugiere una cascada degenerativa, posiblemente asociada con el aumento en las tensiones de deformación dadas por la carga asimétrica.

Especialidad: Bibliografía - Traumatología