La Hipertermia Induce el Aumento de la Radiosensibilidad de las Células Tumorales

• AUTOR: Xu M, Myerson RJ, Roti Roti JL y colaboradores
• TITULO ORIGINAL:The Effects of 41º C Hyperthermia on the DNA Repair Protein, MRE11, Correlate with Radiosensitization in Four Human Tumor Cell Lines
• CITA: International Journal of Hyperthermia 23(4):343-351, Jun 2007
• MICRO: La exposición a la hipertermia moderada produce la translocación de proteínas nucleares de reparación del ADN y aumenta la sensibilidad de las células tumorales a la radioterapia.

Introducción

Si bien la hipertermia es uno de los mecanismos de radiosensibilización más potentes conocidos, los estudios realizados sobre tejidos tumorales con temperaturas muy elevadas (43º C) no fueron exitosos. De todos modos, los resultados observados en distintos ensayos clínicos permiten afirmar que la radiosensibilidad inducida por la hipertermia aumenta la eficacia de la radioterapia. Por lo tanto, los autores señalan que se debe mejorar la comprensión de los mecanismos de acción de la hipertermia moderada de 41º C, que parece incrementar la sensibilidad a las radiaciones a través de sus efectos sobre las proteínas encargadas de la reparación del ADN.

El conocimiento en esta área se ha incrementado de manera importante en los últimos años. Muchos investigadores coinciden al confirmar la acción de la temperatura sobre las proteínas relacionadas con estos procesos de reparación de los ácidos nucleicos, en especial sobre la MRE11. Esta sustancia forma, junto con otras proteínas, un complejo molecular involucrado en algunas vías metabólicas de reparación de la doble hélice de ADN.

En una publicación anterior, los autores describieron que la hipertermia de 41º C indujo la translocación de la MRE11 del núcleo celular al citoplasma, lo que provocó la disociación del complejo molecular formado por esta proteína y la Rad50, en líneas celulares NSY procedentes de adenocarcinoma colónico humano. De acuerdo con estos resultados, proponen que la disponibilidad de la MRE11 es uno de los mecanismos involucrados en la sensibilidad del ADN a los efectos de la radiación, al menos en esa línea celular, e intentan evaluar si el mismo fenómeno se produce con otros tejidos.

Materiales y métodos

Los autores eligieron cuatro líneas celulares: HeLa S3 (derivada de carcinoma de cérvix), HT29, HCT15 y la antes mencionada NSY. Estos cultivos, en desarrollo a 37º C, fueron expuestos a 41º C y luego fueron irradiados a una tasa de 0.9 grays (Gy)/min. La temperatura se redujo a los niveles iniciales y se prolongó la exposición radiante por otros 10 minutos.

Los tejidos fueron procesados por técnicas convencionales y se determinó la concentración celular de cada uno. Además, las células obtenidas se sembraron en medios de crecimiento adecuados durante dos semanas, a 37º C. Por otro lado, se mantuvieron cuatro líneas celulares como grupo control, sin exposición a hipertermia ni a radiación.

Una vez concluido el período de estudio, todos los cultivos fueron tratados por tripsinización y luego fueron centrifugados para separar los componentes nucleares de los citoplasmáticos. Las muestras fueron sometidas a electroforesis, luego de la cual se incubaron sobre membranas de nitrocelulosa. Después se incubaron junto con anticuerpos monoclonales murinos anti-MRE11 y antiactina. Posteriormente, las células se tiñeron mediante técnicas de inmunofluorescencia indirecta con el uso de los anticuerpos mencionados.

Resultados

Los autores mencionan que, para evaluar la relación entre la proteína MRE11 y la radiosensibilización, eligieron cuatro líneas celulares con diferente grado de sensibilidad a las radiaciones ionizantes. Para un mejor análisis, se trazaron curvas de supervivencia para las distintas dosis aplicadas (0, 6 y 8 Gy) después de una exposición a hipertermia moderada de hasta ocho horas. Se definió la tasa de refuerzo térmico (TRT) como la relación entre las dosis que permitieron alcanzar niveles de supervivencia en promedio de 0.1 o de 0.01.

Para las células HeLa, se requirió una exposición de seis horas para obtener una TRT de 1.2 o más, mientras que fueron suficientes dos horas para los cultivos de las células NSY. Asimismo, se necesitaron cuatro horas de exposición a 41º C para lograr la TRT mencionada en la línea celular HT29. Sobre la base de los diferentes intervalos de hipertermia y de los valores de TRT obtenidas, los autores sostienen que las cuatro líneas celulares estudiadas representan un sistema apropiado para evaluar la relación entre la translocación nuclear de la MRE11 y la radiosensibilización inducida por la temperatura.

Antes de observar las consecuencias de la hipertermia entre la distribución nuclear y la distribución citoplasmática de la MRE11, se midieron sus concentraciones totales con la utilización como parámetro de la cantidad de actina de la muestra. Para obtener un indicador preliminar de que los efectos de la hipertermia sobre la MRE11 se asocian con una mayor radiosensibilidad, se graficaron a través del análisis estadístico los promedios de las concentraciones de esta proteína y de la actina respecto de la TRT. Se obtuvo una correlación lineal con un valor de p = 0.01, lo que sugirió que los efectos de la temperatura sobre la MRE11 guardaban relación con el aumento de la radiosensibilidad.

Se midió también la distribución intracelular de la MRE11 mediante la tinción con técnicas de inmunofluorescencia. En la línea HCT15 sólo se observó una mínima translocación del núcleo al citoplasma después de ocho horas de exposición a la hipertermia. Por el contrario, con sólo dos horas de calentamiento las células NSY habían perdido casi la totalidad del contenido nuclear de la proteína analizada. Los cultivos de células HeLa y HT29 mostraban resultados intermedios (seis y cinco horas, respectivamente). En promedio, el tiempo necesario para provocar la translocación de la proteína MRE11 al citoplasma era similar al requerido para obtener una TRT de 1.12 o superior.

En forma paralela, los investigadores verificaron que en los productos de la lisis y de la centrifugación de los cultivos sometidos a hipertermia, las concentraciones citoplasmáticas de MRE11 aumentaban de manera inversamente proporcional al descenso de las concentraciones nucleares.

Este efecto era diferente en cada línea celular estudiada y guardaba relación con el tiempo de exposición al calor, según los autores verificaron a través de la electroforesis de los productos obtenidos. De acuerdo con el ajuste estadístico efectuado, la concentración residual de MRE11 nuclear parecía ser un factor crítico asociado con la radiosensibilidad.

Discusión

Si bien la hipertermia es uno de los radiosensibilizadores conocidos más potentes, su mecanismo de acción permanece desconocido. Aunque es motivo de debate, se sospecha que la inhibición de la reparación de la doble hélice de ADN desempeña un papel importante. Así, las células mutantes con alteraciones tanto en la reparación homóloga como en la no homóloga, pese a ser más radiosensibles, tienen valores de TRT semejantes a las de las células normales. Por lo tanto, se considera que ninguno de estos mecanismos resulta de importancia crítica en la radiosensibilización inducida por la hipertermia.

Algunos estudios recientes destacan que un complejo molecular proteico se fija en las regiones dañadas del ADN antes de iniciarse el proceso de reparación. Entre las proteínas involucradas en esta tarea se describe a la MRE11. A través de la inducción de hipertermia moderada o de hipertermia elevada, esta sustancia se transloca del núcleo celular al citoplasma. Además, se produce el aumento de la asociación entre la MRE11 y la proteína HSP70. En consecuencia, la hipertermia induce modificaciones en la distribución intracelular de la proteína MRE11 y de sus asociaciones moleculares, que parecen ser los mecanismos involucrados en el aumento de la radiosensibilidad inducida por la temperatura.

De manera similar, más allá de los diferentes tiempos de exposición necesarios para cada línea celular, las concentraciones citoplasmáticas y nucleares de la MRE11 guardaron una correlación positiva con la TRT. De esta manera, los autores afirman que la hipertermia reduce la biodisponibilidad de la MRE11 necesaria para reparar el ADN y contribuye a aumentar la sensibilidad a las radiaciones de las células sometidas a temperaturas altas. De todos modos, aclaran los investigadores que éste no parece ser el único mecanismo involucrado, de acuerdo con los modelos de análisis efectuados, ya que no toda la MRE11 es desplazada hacia el citoplasma por la formación de agregados moleculares con la matriz nuclear.

Otro mecanismo propuesto para explicar la mayor radiosensibilidad asociada con la hipertermia es la redistribución del ciclo celular, si bien la mayor parte de las células expuestas a una temperatura a 41º C parecen conservarse en la fase S.

Conclusiones

Los autores señalan que se necesitan diferentes cantidades de calor para inducir un aumento de la radiosensibilidad en distintas líneas celulares procedentes de tejidos humanos neoplásicos. Del mismo modo, el tiempo de exposición a la hipertermia que se requiere para lograr una redistribución significativa de la MRE11 del núcleo al citoplasma en estos cultivos es variable para cada tipo celular.

De todas maneras, los investigadores destacan que la relación entre la MRE11 nuclear residual y la TRT coincide en una regresión linear similar para los tejidos estudiados, por lo cual sugieren que los efectos de la hipertermia sobre esta proteína pueden contribuir al aumento de la radiosensibilidad.

Especialidad: Bibliografía - Oncología