Las Hormonas Sexuales Femeninas Modulan el Transporte Alveolar de Sodio

• AUTOR : Laube M, Küppers E, Thome U
• TITULO ORIGINAL : Modulation of Sodium Transport in Alveolar Epithelial Cells by Estradiol and Progesterone
• CITA : Pediatric Research 69(3):200-205, Mar 2011
• MICRO : El estradiol y la progesterona aumentan el transporte de sodio en las células epiteliales alveolares, al incrementar la expresión y la función de los canales epiteliales de sodio en la membrana apical y de la bomba Na,K-ATPasa en la membrana basolateral. Estos mecanismos explicarían los efectos beneficiosos de las hormonas sexuales femeninas en el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Introducción

En las células alveolares, los iones de sodio son continuamente transportados desde el lado apical hacia la superficie basolateral. Los canales epiteliales para el sodio (CENa) en la membrana apical permiten el ingreso del ion en el espacio intracelular, que se elimina por acción de la bomba Na,K-ATPasa en la membrana basolateral. El gradiente osmótico que se genera ocasiona la depuración del líquido alveolar (DLA), esencial para la supervivencia posnatal, como lo demuestran los estudios en ratones con deficiencia de la subunidad alfa formadora de poros de los CENa. Por su parte, en los sujetos adultos con síndrome de dificultad respiratoria (SDR) aguda, la supervivencia depende de la eficacia de la DLA.

En los recién nacidos prematuros con SDR hay una reducción del transporte epitelial de sodio y menor expresión de los CENa, en comparación con los recién nacidos prematuros sin el síndrome o los recién nacidos de término. Asimismo, los resultados de un estudio sugirieron que la menor DLA contribuiría en la etiopatogenia del SDR; por este motivo, los tratamientos destinados a aumentar el transporte de sodio y la DLA podrían mejorar la supervivencia y reducir la morbilidad en los recién nacidos prematuros y en los adultos con SDR.

Al menos 2 trabajos mostraron que los corticosteroides aumentan el transporte vectorial de sodio; además, modifican considerablemente las propiedades biofísicas de los CENa. Es posible que las hormonas sexuales femeninas también participen en la regulación de la DLA, ya que las mujeres con SDR aguda tienen mayor DLA y mejor supervivencia respecto de los hombres; igualmente los recién nacidos prematuros de sexo femenino tienen índices más altos de supervivencia y presentan con menor frecuencia enfermedades pulmonares que los de sexo masculino. Además, se comprobó que los recién nacidos prematuros con SDR tienen niveles séricos más bajos de estrógenos y progesterona. Por último, los varones con fibrosis quística (una enfermedad caracterizada por la menor secreción de cloro y por la absorción excesiva de sodio) tienen una evolución más favorable que las niñas, probablemente como consecuencia de los efectos de las hormonas sexuales femeninas sobre la absorción de sodio y la densidad del moco. Los hallazgos en otros modelos con animales avalan la participación de los estrógenos y la progesterona en la DLA.

 

En la presente investigación, los autores analizaron los efectos de las hormonas sexuales femeninas sobre el transporte vectorial de sodio, los CENa, la bomba Na,K-ATPasa, el regulador de conductancia transmembrana (CFTR por sus siglas en inglés) de la fibrosis quística y la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en células epiteliales pulmonares distales (CEPD) de fetos de ratas.

Materiales

Los experimentos se llevaron a cabo en CEPD de fetos murinos de 18 a 19 días de edad gestacional, cultivadas en ausencia de estradiol (E2) y progesterona (P; medio 1), o en presencia de diferentes concentraciones de E2 y progesterona (0.01 µM de E2 [medio 2]; 0.01 µM de E2 y 0.1 µM de P [medio 3]; 0.28 µM de E2 y 0.037 µM de P [medio 4]; 0.0037 µM de E2 y 2.8 µM de P [medio 5] y 1 µM de E2 y 1 µM de P [medio 6]). Para la determinación de las propiedades bioeléctricas de las monocapas de CEPD sólo se incluyeron en los análisis los experimentos en los que se comprobó una resistencia transepitelial (Rte) superior a 300 ohms cm2. Las diferencias se analizaron con pruebas de ANOVA y post hoc de Dunnett.

Las células fueron perfundidas con una solución con Na+ (135 mM); K+ (5 mM); Ca2+(1 mM); Mg2+ (4 mM); Cl- (10 mM), gluconato (135 mM), HEPES (10 mM), glucosa (5 mM) y manitol (10 mM). La despolarización celular se logró mediante la exposición a una solución con K+ (135 mM); Mg2+ (5 mM); Cl- (10 mM); gluconato (135 mM); HEPES (10 mM), glucosa (5 mM) y manitol (20 mM) a pH 7.4. Se determinaron las corrientes de cortocircuito (ISC). Se utilizó reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para conocer la expresión de ARN mensajero (ARNm) para las subunidades alfa, beta y gamma de los CENa; la subunidad alfa-1 y beta-1 de la Na,K-ATPasa, los receptores para estrógenos alfa y beta, el CFTR y el VEGF-A. Mediante inmunoelectrotransferencia (Western blot) se evaluó la expresión de las proteínas correspondientes.

Resultados

Las CEPD utilizadas en los estudios electrofisiológicos se obtuvieron de 15 cultivos diferentes. Un total de 333 de las 545 monocapas tuvieron una Rte > 300 ohms cm2; (644 ± 281 ohms cm2).

La ISC basal (µA/cm2) aumentó significativamente con la exposición a E2 o E2/P (p < 0.01). El mayor incremento, de 10.05 ± 0.25 a 12.09 ± 0.69, se comprobó en las monocapas cultivadas con 0.28 µM de E2 y 0.037 µM de P (p < 0.05). La corriente sensible a la amilorida (IAMIL) aumentó en forma sustancial en presencia de E2 y de E2/P (p < 0.0001). El mayor incremento se constató en las monocapas expuestas al medio 4 (de 7.80 ± 0.20 a 9.87 ± 0.50). La corriente sensible a la ouabaína (IOUAB) también aumentó en presencia de E2 y P (p < 0.001); el incremento más importante, de 8.18 ± 0.22 a 10.24 ± 0.51, también se observó en el mismo medio. Las máximas diferencias en las corrientes, de alrededor de 20%, se registraron entre las monocapas expuestas a este medio y aquellas no tratadas con E2 ni P (medio 1).

En los experimentos de permeabilización, la corriente basal de las monocapas fue globalmente mayor (p < 0.0001) y estuvo especialmente aumentada en los medios 2 y 4 (p < 0.05); luego de la permeabilización de la membrana apical con anfotericina B, la ISC aumentó en alrededor de 50% y más intensamente en las monocapas cultivadas en el medio 4. El componente sensible a la ouabaína de la ISC inducida por anfotericina B (ouabmáx) aumentó significativamente en presencia de E2 y E2/P (p < 0.001); la respuesta máxima se observó en el medio 4, con un aumento cercano al 35%. Este fenómeno no ocurrió en los medios 5 y 6. El componente sensible a la amilorida de la ISC inducida por anfotericina B (amilmáx) también se incrementó en presencia de E2 y P (p < 0.001); sin embargo, el aumento fue mayor en el medio 5, enriquecido en P.

El análisis de ARNm de las CEPD mostró patrones distintos de expresión de los transportadores de iones. Se comprobó mayor expresión de las subunidades alfa y beta de los CENa en presencia de E2 y P. La expresión de la subunidad alfa de los CENa aumentó más de 3 veces en el medio 5 y más de 2 veces en el medio 6, en comparación con el medio 1 (p < 0.01 en ambos casos), en tanto que la expresión de la subunidad beta de los CENa aumentó hasta un 190% en los medios 4 y 6 respecto del medio 1 (p < 0.01). No se observaron cambios importantes en la expresión de la subunidad gamma de los CENa.

La expresión de la subunidad beta 1 de la bomba Na,K-ATPasa aumentó entre 40% y 60% en presencia de E2 y P, sin diferencias importantes en los medios con distinta concentración hormonal. Hubo un incremento significativo de la expresión del ARNm para el CFTR en los medios 5 y 6; la misma tendencia se observó en los cultivos en el medio 4. La expresión del VEGF no se modificó en presencia de E2 ni P. Las CEPD no expresaron receptores alfa para estrógenos, en tanto que la expresión del receptor beta disminuyó en presencia de E2 y P.

El Western blot reveló las 3 subunidades de los CENa en los mismos lisados celulares, en bandas de 90 a 110 kD; no obstante, la expresión de las subunidades beta y gamma fue mucho más baja en comparación con la expresión de la subunidad alfa. En los medios 4, 5 y 6, la expresión de las subunidades beta y gamma de los CENa tendió a ser mayor, pero las diferencias fueron leves. El tratamiento con E2 o P no modificó el patrón de expresión de ninguna de las subunidades de la bomba Na,K-ATPasa.

Discusión

En el presente estudio se analizaron por primera vez los efectos diferenciales del estradiol y la progesterona sobre los canales apicales de sodio y la actividad de la Na,K-ATPasa en las CEPD. Los incrementos de la ISC basal, IAMIL, IOUAB, ouabmáx y amilmáx en las monocapas expuestas a estradiol, en concentración de hasta 0.28 µM (en el medio 4), sugieren que esta hormona ejerce efectos estimulantes sobre los CENa y la Na,K-ATPasa. En cambio, en presencia de concentraciones altas de progesterona (1-2.8 µM, en los medios 6 y 5, respectivamente), las corrientes y la expresión de la Na,K-ATPasa tendieron a disminuir, fenómenos que indicarían efectos tóxicos de la hormona. Por el contrario, en los medios con concentraciones altas de progesterona y bajas de estradiol (medio 5), se comprobó predominantemente un incremento de la actividad de los CENa, a juzgar por los efectos estimulantes sobre la corriente amilmáx pero no sobre la corriente ouabmáx. Por lo tanto, es posible que la disminución basal de la ISC en los medios 5 y 6 obedezca a la menor actividad de la Na,K-ATPasa.

En los medios 2 y 3 (en los cuales se reprodujeron las condiciones hormonales de la gestación en las ratas), la estimulación de la actividad de los canales apicales de sodio fue más leve.

La combinación de estradiol y progesterona (por ejemplo en el medio 5) se asoció con un efecto más importante sobre el transporte epitelial de sodio en comparación con la exposición exclusiva a estradiol (en el medio 2). Si bien este hecho podría sugerir una influencia más pronunciada de la progesterona, los resultados indican que los mecanismos de señalización y las interacciones entre ambas hormonas son mucho más complejos.

En el transporte vectorial de iones en las células intactas siempre participan transportadores apicales y basolaterales; en el presente estudio, mediante la permeabilización selectiva, los autores pudieron separar los efectos de las hormonas sobre la actividad de la Na,K-ATPasa basolateral y de los canales apicales de sodio. La función de la Na,K-ATPasa aumentó en presencia de las hormonas sexuales femeninas, un hallazgo que no se refirió con anterioridad para las células epiteliales. En un estudio previo se comprobaron niveles más altos de expresión de la subunidad alfa de los CENa en los pulmones de ratas hembra respecto de los machos; además, la administración de estradiol y progesterona a ratas inmaduras o sometidas a ovariectomía se asoció con mayor expresión del ARNm de las subunidades alfa y gamma de los CENa después de 24 horas. El mayor número de CENa activos, en asociación con la exposición a estradiol y progesterona, coincidió con las determinaciones de la ISC.

En el presente ensayo se demostró un incremento de la expresión del ARNm de las subunidades alfa y beta de los CENa en los medios con estradiol y progesterona; sin embargo, el mayor incremento de la subunidad alfa se constató en el medio con la concentración más alta de progesterona (5), en el cual también se comprobó el aumento más importante de la corriente amilmáx. A diferencia de los experimentos en animales, en el presente estudio en cultivos celulares, la expresión de la subunidad gamma de los CENa no aumentó; en cambio, se comprobó un incremento de la expresión de la subunidad beta. Los resultados sugieren una modulación diferencial de las subunidades de los CENa por las hormonas sexuales femeninas. El estradiol y la progesterona, en todas las concentraciones evaluadas, se asociaron con mayor expresión de la subunidad beta-1 de la Na,K-ATPasa, un fenómeno que podría explicar el aumento de la corriente IOUAB en presencia de estradiol. En un trabajo anterior, la incubación con estradiol y progesterona también se asoció con mayor expresión del ARNm de los CFTR; en el presente estudio se observó el mismo efecto, lo que confirma la influencia decisiva de las hormonas sexuales femeninas en la síntesis de los transportadores de iones. El incremento del transporte vectorial de sodio de un 20% coincidió con la mayor densidad de las subunidades beta y gamma de los CENa en los Western blot. Si bien la expresión de la Na,K-ATPasa se mantuvo casi sin cambios en los medios de cultivo 2 y 4, los resultados de los Western blot no descartan una elevación menor, pero suficiente para explicar los cambios electrofisiológicos encontrados, ya que los lisados celulares también incluyen proteínas almacenadas en el retículo endoplásmico.

Algunos efectos inducidos por el estradiol y la progesterona también podrían obedecer a otros canales de iones, por ejemplo los de K+, los cuales constituyen una parte elemental de la maquinaria que interviene en el transporte de sodio en la membrana basolateral, en el reciclado del potasio y en la modulación del potencial de membrana en condiciones de reposo. Al menos 2 trabajos mostraron que en otros tejidos, los canales de potasio están regulados por el estradiol. Por el momento, se desconoce si los canales de potasio en las células epiteliales están regulados por la progesterona o el estradiol.

En las CEPD no sólo tiene lugar la absorción de sodio sino también la secreción de cloro, por lo cual se utilizaron inhibidores específicos del transporte epitelial de sodio, como la amilorida y la ouabaína. Así, fue posible discriminar los efectos de las hormonas sobre los CENa y en la actividad de la bomba Na,K-ATPasa.

Los resultados indican que la función de los CENa y de la Na,K-ATPasa, en CEPD murinas, aumenta en presencia de estradiol y de estradiol en combinación con progesterona. La actividad de los CENa parece incrementarse especialmente en presencia de concentraciones altas de progesterona, en tanto que la función de la Na,K-ATPasa estaría regulada fundamentalmente por el estradiol. Ambas hormonas podrían mejorar la DLA y acelerar la resolución del edema pulmonar. Asimismo, explicarían los efectos favorables del estradiol en el SDR de los recién nacidos y las diferencias en la supervivencia en los pacientes con SDR aguda en relación con el sexo. Por el contrario, en la fibrosis quística las acciones estimulantes de la progesterona y del estradiol podrían agravar la actividad exagerada de los CENa, un trastorno asociado con la enfermedad; de hecho, el pronóstico es más favorable en los hombres, concluyen los autores.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología - Pediatría