Las Muestras Secas de Exfoliado Cervical Permiten Identificar el Virus del Papiloma Humano

• AUTOR : Feng Q, Cherne S, Kiviat N y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Evaluation of Transported Dry and Wet Cervical Exfoliated Samples for Detection of Human Papillomavirus Infection
• CITA : Journal of Clinical Microbiology 48(9):3068-3072, Sep 2010
• MICRO : El uso de muestras cervicales secas almacenadas a temperatura ambiente permite detectar el virus del papiloma humano, aunque con mayor porcentaje de muestras insuficientes y con una sensibilidad algo inferior que las conservadas en medio húmedo.

Introducción

El virus del papiloma humano (HPV) es el agente etiológico de las verrugas genitales y de lesiones preneoplásicas; algunos subtipos de HPV se asocian con el cáncer de cuello uterino, que afecta a casi medio millón de mujeres a nivel mundial y presenta una tasa de mortalidad del 50%. El diagnóstico se basa en la citología de rutina, que permite detectar lesiones preneoplásicas y realizar el tratamiento adecuado. Sin embargo, en lugares con bajos recursos en los que se dificulta realizar los extendidos para la citología, se ha sugerido la detección del HPV para la pesquisa del cáncer cervical. La metodología habitual de esta prueba consiste en la recolección de muestras cervicales en un medio líquido. Dado que este método no es viable en algunos lugares, se han propuesto alternativas como la detección en hisopados vaginales autorrealizados.

Habitualmente, la preservación de las células se realiza en medios que requieren refrigeración constante durante el transporte, o que son muy costosos, o presentan otras desventajas, como la de ser inflamables. La posibilidad de evitar el uso de estos medios simplificaría la recolección de muestras en un gran número de pacientes; por este motivo se estudió la detección en muestras secas, aunque siempre se consideró el almacenamiento a 4°C. En ninguna investigación previa se evaluó la recolección de muestras secas y el almacenamiento a temperatura ambiente.

Este es el primer estudio que analiza la estabilidad de las muestras de células de cáncer cervical a temperatura ambiente, así como la detección del HPV en hisopados cervicales secos y conservados en un medio de transporte líquido.

Materiales y métodos

Se emplearon dos líneas celulares de cáncer cervical, Siha y Caski, que fueron colocadas en un tubo seco, almacenadas a temperatura ambiente durante 1 a 4 semanas, y conservadas a -20°C para su procesamiento posterior.

Además, se tomaron muestras cervicales de mujeres que asistieron a un hospital de Guayaquil, Ecuador, entre junio de 2008 y abril de 2009. A cada paciente se le tomaron dos muestras de hisopado, que fueron conservadas en tubos estériles; uno, con un medio de transporte líquido, y el otro, seco. Las muestras se almacenaron a 4°C hasta por 6 meses antes de ser enviadas a un laboratorio central donde se llevó a cabo la detección y genotipificación de los subtipos de HPV. La detección se realizó por amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguida de hibridación por sonda; posteriormente fueron genotipificados mediante el ensayo Luminex, que permite distinguir 37 subtipos de HPV. Además, existen ensayos TaqMan específicos para cada subtipo con PCR en tiempo real, que posibilitan la detección de los siguientes subtipos de HPV: 6, 16, 18, 39, 52, 53 y 66.

Se llevó a cabo una PCR en tiempo real tanto para determinación de beta-actina como de HPV.

Se consideraron de alto riesgo para el desarrollo de neoplasias los subtipos 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, e is39 (11). Se estimó la concordancia positiva entre las muestras seca y húmeda como la cantidad de muestras positivas por ambos métodos dividida por la cantidad de muestras positivas por cada uno de los métodos. Con el mismo criterio, se calculó la concordancia negativa; en ambos casos se aplicó un análisis estadístico para correlacionar los resultados obtenidos con los esperados.

Se empleó el método de regresión logística para evaluar si los distintos diagnósticos citológicos se asociaban con una concordancia positiva con determinados subtipos de HPV en las muestras secas y húmedas. La prueba t para muestras apareadas sirvió para comparar las cargas virales de beta-actina y HPV en las muestras secas en comparación con las muestras húmedas.

Resultados

Se realizó la determinación de ADN de HPV y de beta-actina en las líneas celulares de cáncer cervical conservadas a temperatura ambiente por períodos variables entre 1 y 4 semanas, y posteriormente a -20°C. La cuantificación relativa de beta-actina varió entre 0.75 y 3.25, y para HPV-16 entre 0.69 y 5.31.

Se incluyeron en total 135 pares de muestras, correspondientes a 73 mujeres que acudieron a la cínica de colposcopia y 62 de la clínica para la mujer. En el primer grupo, 2 presentaron citología insuficiente, 2 tenían citología normal, 17 presentaron células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US, por sus siglas en inglés), 43 tenían neoplasia intraepitelial escamosa de bajo grado (LGIN por sus siglas en inglés), 3 de alto grado (HGIN) y 6 tenían cáncer cervical invasivo, mientras que las restantes 62 pacientes tenían citología normal. La media de edad fue de 38.2 ± 11.5 años, con una media superior para las concurrentes a la consulta clínica de colposcopia (44.4 ± 11.4 años) que para las remanentes (31.2 ± 6.7 años; p < 0.001).

De los 135 pares de muestras analizadas, no pudo determinarse el HPV por muestra insuficiente en una de las muestras húmedas (0.7%) y en 9 de las muestras secas (6.7%; p < 0.01). Se detectaron subtipos de HPV de alto riesgo en el 23.1% de las muestras húmedas, con 48 infecciones por tipos específicos de alto riesgo, y en el 24.6% de las muestras secas, con 43 infecciones por subtipos específicos de HPV de alto riesgo. Entre los 125 pares con muestra suficiente, 25 fueron positivas para HPV de alto riesgo en ambas, 6 fueron sólo positivas en la muestra húmeda y 5 en la seca, y 89 fueron negativas, lo que resulta en una proporción de concordancia positiva del 69.4%. Al considerar los 19 subtipos de alto riesgo de HPV, se encontró una proporción de concordancia positiva para todos los subtipos específicos del 60.7%, mientras que la proporción de concordancia negativa para cualquier tipo de alto riesgo entre las muestras secas y húmedas fue del 89% y aquella para los subtipos específicos de alto riesgo de HPV fue del 99.1%.

En función del diagnóstico citológico, se evaluó la concordancia entre las muestras secas y húmedas. En el grupo con citología normal, la concordancia positiva para subtipos específicos de alto riesgo de HPV fue del 45.0%; en el caso de citología anormal (ASC- US, LGIN, HGIN y cáncer invasivo) la concordancia positiva trepó al 69.4%. La presencia de citología anormal se asoció con un aumento cercano a la significación estadística de concordancia positiva con todos los subtipos de alto riesgo de HPV; la concordancia negativa con todos los subtipos específicos de HPV de alto riesgo fue del 99% en pacientes con citología normal y del 99.1% en aquellas con estudios citológicos anormales.

Entre las 9 pacientes con HGIN o cáncer invasivo, 3 presentaron una muestra húmeda negativa para HPV de alto riesgo y otra presentó una muestra insuficiente para determinación del ADN de HPV, mientras que 2 tuvieron una muestra seca negativa para HPV de alto riesgo.

Con el fin de evaluar si el ADN era degradado especialmente en las muestras secas, se realizó la determinación de beta-actina, para evaluar el ADN genómico, y de ADN-HPV. En 42 pares de muestras se determinó beta-actina, que resultó evaluable en 38. La cantidad de beta-actina fue 19.5 veces más baja en las muestras secas que en las húmedas (p < 0.001). La carga viral de HPV fue no detectable en la muestra seca (en dos pares), en la muestra húmeda (en un par) o en ambas muestras (dos pares); los restantes 27 pares tuvieron una carga viral significativamente menor en la muestra seca (p = 0.013) y la diferencia fue mayor para la beta-actina que para el HPV (p < 0.001).

Discusión

La evaluación de las líneas celulares de cáncer cervical conservadas en condiciones secas a temperatura ambiente permitió comprobar que no existe degradación significativa del ADN, tanto al considerar la cuantificación de beta-actina como de HPV. Respecto de las muestras clínicas, aquellas conservadas en seco fueron con mayor frecuencia insuficientes para la detección de ADN viral, mientras que la detección y cuantificación de subtipos de HPV fue algo superior en las muestras húmedas que en sus pares secas. La concordancia positiva entre las muestras secas y húmedas para subtipos de HPV de alto riesgo fue del 60.7%, y fue mayor en las pacientes con ASC-US que en aquellas con citología negativa.

Se demostró que la cantidad de degradación de ADN genómico fue mayor que la de ADN de HPV en las muestras secas respecto de las húmedas. La sensibilidad de la detección de ADN de HPV de alto riesgo fue similar en las muestras secas y húmedas en las mujeres con lesiones significativas (HGIN o cáncer invasivo).

Existe un solo antecedente de comparación entre muestras secas y húmedas, en el que se evaluaron hisopados vaginales secos y húmedos y cervicales húmedos; la concordancia positiva entre los hisopados vaginales secos y húmedos fue del 68.9%, con un nivel de detección similar de subtipos de HPV.

Otro abordaje al estudio fue la toma de muestra de exfoliado cervical con hisopado seco, y extendido directamente sobre papel de filtro estéril. De este modo, la conservación no requiere medio de transporte, y se puede mantener a temperatura ambiente hasta por un año. Si bien algunos estudios demostraron una correcta identificación de muestras con HPV con este método, en otros trabajos se detectaron menos subtipos de HPV y menor cantidad de infecciones por múltiples subtipos de HPV.

El análisis de las líneas celulares de cáncer cervical demostró que no existía degradación del ADN en las muestras secas; sin embargo, en las muestras clínicas los resultados fueron opuestos. Se comprobó una degradación significativa del ADN en las muestras secas, predominantemente genómico.

Los resultados de este estudio indican que el uso de muestras cervicales secas almacenadas a temperatura ambiente permite la detección del HPV, aunque con mayor porcentaje de muestras insuficientes y con una sensibilidad algo inferior. Si bien se observó una degradación significativa del ADN genómico en estas muestras, el efecto sobre el ADN de HPV fue mínimo.

Especialidad: Bibliografía - Ginecología