Los Hepatocitos con Virus de la Hepatitis C en Replicación Inducen la Activación Fibrogénica de las Células de Kupffer

• AUTOR : Schulze-Krebs A, Preimel D, Popov Y y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Hepatitis C Virus-Replicating Hepatocytes Induce Fibrogenic Activation of Hepatic Stellate Cells
• CITA : Gastroenterology 129(1):246-258, Jul 2005
• MICRO : Los genes no estructurales del virus de la hepatitis C inducen un incremento en la expresión del factor transformador del crecimiento beta 1 y de otros factores profibrogénicos en los hepatocitos infectados.

Introducción

Más de 200 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC), el cual produce enfermedad hepática crónica en el 50% a 70% de los pacientes, 15% a 20% de los cuales presentará cirrosis dentro de los 20 años siguientes a la infección. La cirrosis es un prerrequisito para la aparición de carcinoma hepatocelular relacionado con el VHC, que se produce a una tasa anual de 2% a 3%. La progresión de la enfermedad hepática no se correlaciona con el grado de inflamación histológica o serológica y la mayoría de las infecciones se diagnostican por casualidad o en un estadio avanzado, cuando las complicaciones comienzan a hacerse clínicamente evidentes. En la actualidad, la mejor terapia disponible es la combinación de interferón alfa pegilado y ribavirina. La terapia combinada puede llevar a la eliminación viral en hasta 50% a 80% de los pacientes con genotipos 1 y 2 o 3, respectivamente. Para las personas que no responden al tratamiento antiviral o que se encuentran en un estadio avanzado de la enfermedad, sería importante la implementación de una terapia antifibrótica que pueda interrumpir la progresión de la fibrosis o aun revertirla. El VHC es un flavivirus con envoltura que contiene ARN con aproximadamente 9 600 nucleótidos que codifican una poliproteína que es clivada por proteólisis en 10 proteínas estructurales y no estructurales. El hígado es el principal órgano para la replicación del VHC, aunque los niveles hepáticos de ARN y proteína del VHC son usualmente bajos. Se sugirieron como sitios de replicación viral, además de los hepatocitos, las células mononucleares. Existen 6 genotipos del VHC y el tipo 1 es el principal en Europa y en los EE.UU. La fibrosis hepática es consecuencia de la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (MEC), una disminución de las metaloproteinasas de matriz (MPM) que remueven los componentes de la MEC y un incremento de los inhibidores tisulares de las MPM (ITMP), principalmente ITMP-1. El colágeno, las MPM y los ITMP son producidos principalmente por los miofibroblastos (MF) que derivan de las células de Kupffer (CK) hepáticas o de los fibroblastos perivasculares o portales activados. Las CK o las endoteliales activadas, el epitelio de los conductos biliares en proliferación y otras células mononucleares o aun los MF son fuente de citoquinas fibrogénicas y factores de crecimiento que estimulan las CK y los fibroblastos perivasculares o portales para convertirse en MF. La citoquina profibrogénica principal es el factor transformador del crecimiento beta 1 (TGF-beta1) que es liberado por la mayoría de los tipos celulares durante la inflamación, la regeneración tisular y la fibrogénesis. El TGF-beta1 produce aumento de la producción y depósito de los componentes de la MEC y disminución de la mayoría de las MPM. El VHC puede modular el metabolismo de los hepatocitos infectados. De este modo, el núcleo (core) y las proteínas no estructurales NS3 y NS5 pueden provocar la alteración del metabolismo lipídico, lo cual puede a su vez llevar a la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO); se sabe que éstas inducen TGF-beta1, el cual puede inducir la formación de ERO. Sin embargo, no se ha demostrado un papel profibrogénico claro de los hepatocitos infectados por el VHC. Los autores investigaron los mecanismos por los cuales el VHC puede producir fibrosis hepática, independientemente de la inflamación, mediante la utilización de la línea celular Huh-7 5-15 del hepatoma humano (replicón del VHC) que expresa los genes virales de proteínas no estructurales NS3 a NS5 y de CK/MF como células efectoras fibrogénicas.

Materiales y métodos

Se utilizaron los siguientes tipos celulares: el clon Huh-7 5-15, el clon transinfectado Huh-7, CK/MF humanos y las células CFSC-2G de rata. La línea celular Huh-7 5-15 del hepatoma humano expresa los genes virales de proteínas no estructurales NS3 a NS5 del genotipo 1b del VHC, que es responsable de la replicación viral. El clon Huh-7 transinfectado contiene sólo el vector parental pcADN3. Las células CFSC-2G de rata representan una línea de CK con activación intermedia. Las CK/MF y las células CFSC-2G se incubaron con un medio acondicionado proveniente del cultivo de Huh-7 5-15 o Huh-7 pcADN3. Las líneas celulares Huh-7 5-15 o las Huh-7 pcADN3 se cultivaron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 0.2% de suero bovino fetal (FCS) sin neomicina por 72 horas. El medio acondicionado se suplementó con 250 µg/ml de anti-TGF-beta1 de conejo o inmunoglobulina G (Ig G) de conejo inespecífica en la misma concentración por 60 minutos. La expresión de los genes relacionados con la fibrosis y de la MEC se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real; mientras que la cuantificación del TGF-beta1 y de las MPM 1 y 2 y su inhibidor ITMP se determinó por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En cuanto a la metodología estadística, todos los análisis se efectuaron mediante la prueba de la t de Student; los resultados se expresaron como media ± desvío estándar.

Resultados

Los niveles de transcripción del TGF-beta1 fueron 3 veces más altos en las células Huh-7 5-15 en comparación con las células Huh-7 pcADN3 utilizadas como control; mientras que la expresión de otros genes relacionados con la fibrosis como el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), procolágeno alfa 1 (I) y MPM-1, 2 o 3 fueron indetectables. Los niveles de ARNm del TGF-beta1 y de ARNm de NS3 se incrementaron de un modo dependiente del tiempo, con un aumento de 2.5 veces y 2 veces, respectivamente después de 96 horas en las células Huh-7 5-15. En concordancia con los niveles de ARNm, la proteína TGF-beta1 aumentó 6 veces en el medio acondicionado de las células Huh-7 5-15, pero no en el de las células transinfectadas Huh-7 pcADN3. Las CK hepáticas mostraron un perfil de expresión genética profibrogénico cuando se expusieron al medio acondicionado de las células Huh-7 5-15. En las células de rata (CFSC-2G) no hubo un incremento detectable en los niveles de ARNm de TGF-beta1 cuando se expusieron al medio acondicionado derivado de las células Huh-7 5-15 o las células transinfectadas Huh-7 pcADN3. Sin embargo, se observó un aumento de 5 veces en los niveles de ARNm de CTGF después de 48 horas de incubación en el medio acondicionado derivado de las células Huh-7 5-15 comparado con el de las células Huh-7 pcADN3. Después de 24 a 72 horas de incubación de las CFSC-2G en el medio acondicionado derivado de las células Huh-7 5-15 se produjo un incremento al doble de los niveles de ARNm del procolágeno alfa 1 (I), en 5 veces del ARNm del procolágeno alfa 1 (III). Los niveles de ARNm de MPM-2 se cuadruplicaron 48 horas después de la adición del medio acondicionado de las células Huh-7 5-15 y permanecieron elevados a las 72 horas; mientras que hubo una disminución en 10 veces de los niveles de transcripción de los genes de MPM-3 y MPM-13. La disminución del ARNm de la MPM-13 se acompañó de un incremento al doble del ITMP-1. De forma similar, en las CK/MF humanas se encontró un incremento en la expresión de ARNm del CTCG en 9 veces luego de 72 horas de incubación en el medio acondicionado proveniente de las células Huh-7 5-15; mientras que el ARNm del procolágeno alfa 1 (I) aumentó 4.5 veces después de 48 horas. Se observó una tendencia hacia la disminución de la MPM-1, que degrada el colágeno tipo I, acompañada por el aumento en la expresión de su inhibidor ITMP-1 y de MPM-2. No hubo alteración en la expresión de TGF-beta1 con la exposición en el medio acondicionado de las células Huh-7 5-15. Después de la incubación de las CK con el medio acondicionado en presencia de anti-TGF-beta1, se bloqueó el 60% a 70% de la actividad profibrogénica; mientras que el uso de Ig G inespecífica no influyó sobre la expresión genética profibrogénica.

Discusión

Los autores comentan que los resultados de su estudio demostraron que los niveles de ARNm del TGF-beta1 aumentaron en el replicón del VHC (células Huh-7 5-15). El TGF-beta1 aparentemente actúa como un importante mediador profibrogénico liberado por los hepatocitos infectados por el VHC. No se encontró expresión de otros genes relacionados con la fibrosis como CTCG, procolágeno alfa 1 (I) y alfa 1 (II) y MPM-1, 2 y 3. El incremento en la expresión del TGF-beta1 sugiere que esta citoquina profibrogénica conduce, al menos en parte, la fibrosis hepática inducida por el VHC. El aumento de TGF-beta1 por NS3 a NS5 podría explicarse por la inducción de ERO por estas proteínas no estructurales. El medio acondicionado de las células Huh-7 5-15 indujo el CTGF, pero no la expresión del TGF-beta1 en las células CK. Esto sugiere que el CTGF desempeña un papel en la activación de las CK y la progresión de la fibrosis.

En conclusión, el replicón del VHC liberó factores que indujeron la expresión de una respuesta profibrogénica y suprimieron la respuesta fibrolítica en las CK/MF. El TGF-beta1 es el principal factor profibrogénico liberado de estos hepatocitos; mientras que otros factores tales como CTGF, actuarían como efectores del TGF-beta1 en las CK. La inducción directa de mediadores profibrogénicos por el VHC en los hepatocitos infectados explica la observación frecuente de fibrosis hepática progresiva, a pesar de un bajo nivel de inflamación y sugiere nuevos objetivos terapéuticos para las terapias antifibróticas en la hepatitis C crónica.

Especialidad: Bibliografía - Gastroenterología - Infectología