Morfogénesis de los Túbulos Renales: Implicancia de la Interacción Ácido Hialurónico-CD44

• TITULO : Morfogénesis de los Túbulos Renales: Implicancia de la Interacción Ácido Hialurónico-CD44
• AUTOR : Pohl M, Sakurai H, Stuart R, Nigam S
• TITULO ORIGINAL : Role of Hyaluronan and CD44 in in Vitro Branching Morphogenesis of Ureteric Bud Cells
• CITA : Developmental Biology 224(2):312-325, Ago 2000
• MICRO : El ácido hialurónico mediante su interacción con el receptor CD44 promueve en la yema ureteral un aumento en el número y viabilidad de las células, en la longitud y la ramificación de los procesos y en la expresión de CD44 y genes que regulan la proliferación, supervivencia, adhesión y migración celular y morfogénesis.

Introducción

En el desarrollo embrionario del riñón, el sistema de túbulos se origina de una extensión y ramificación del divertículo metanéfrico o yema ureteral (UB, por su sigla en inglés), el cual es tejido epitelial, y la consecuente interacción con el mesénquima metanéfrico (MM) que lo rodea, el que desarrolla, asimismo, una serie de túbulos que desembocan en el divertículo. Dicho proceso puede ser estudiado por sistemas in vitro, en donde las líneas celulares derivadas de la UB se cultivan en una matriz favorable para su crecimiento, en presencia de medio condicionado de células provenientes del MM. Este sistema resulta de particular interés por la posibilidad de estudiar la participación de la vía de señalización del ácido hialurónico (HA, por su sigla en inglés) y el receptor CD44, en la génesis del sistema tubular del riñón metanéfrico. En este sentido, el HA (glucosaminoglicano formado por repeticiones de disacáridos) constituye parte de la estructura de los proteoglicanos, componentes de la matriz extracelular (MEC), implicados en el desarrollo de la ramificación tubular, debido a su interacción con factores de crecimiento, proteasas e inhibidores de proteasas.

El objetivo del presente trabajo fue determinar la importancia del eje HA- CD44 en la génesis del sistema tubular renal, estableciendo los mecanismos subyacentes en los que participa.

Métodos

Se procedió a realizar cultivos de células de la UB y mesenquimales metanéfricas (BSN) de embriones de ratones transgénicos SV40 large T de 11.5 días. El medio condicionado de las células BSN (BSN-CM, por su sigla en inglés) se obtuvo de su cultivo al llegar a la confluencia durante 3 a 4 días adicionales en medio libre de suero.

De manera de evaluar la formación de colonias derivadas de la UB inducidas por HA, se procedió a crecer estas células (104 células por pocillo de placa de 96) en geles constituidos por: 1 parte de DMEM/F12 (10X), 0.5 partes de bicarbonato de sodio (74 mg/ml), 3.75 partes de colágeno tipo I (3.95 mg/ml) y 3.75 partes de HA (5 mg/ml) o agua.

El número de colonias se determinó luego de 24 a 48 h de cultivo (se consideraron las células y colonias presentes en la estructura tridimensional del gel, exceptuando las células planas, localizadas en los extremos inferior y superior del gel). Asimismo, se determinó la viabilidad celular, luego de 5 días de cultivo, detectando como producto de la segmentación enzimática de la calceína-AM, el sustrato fluorescente, en células metabólicamente activas, y la incorporación del homodímero de etidio en el núcleo de células muertas. Por otra parte se determinó la expresión de la proteína CD44 en células de la UB y BSN, mediante Western Blot, utilizando el anticuerpo anti-CD44 (KM 201), y del ARNm por Northern Blot, aplicando una sonda específica de ADN copia, que reconocía los diferentes transcriptos del ARN. Asimismo, la expresión de CD44 en las células de la UB se evaluó mediante inmunocitoquímica y en los riñones de embriones de ratón de 13 días por inmunohistoquímica. Por otra parte, de manera de determinar la expresión de la hialuronato sintasa (Has) en la UB y en el MM derivados del riñón embrionario de ratas de 13 días, se extrajo el ARN poliadenilado y se lo utilizó para la reacción de la transcriptasa reversa y posterior PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Además, se realizó la detección de múltiples genes (588) mediante arreglos de ADN copia de origen murino.

Resultados

Las células de la UB en cultivo tridimensional formaron un sistema tubular ramificado en presencia de BSN-CM o suero. Asimismo, cuando dichas células crecieron en BSN-CM o en el factor de crecimiento reducido Matrigel con colágeno tipo I, la formación de procesos se extendió en el tiempo y se generaron estructuras tubulares de mayor dimensión con lumen y ramificaciones. No obstante, la adición de HA a cultivos que crecían en colágeno tipo I en presencia de medio libre de suero, HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) (50 ng/ml), BSN-CM o medio con 10% FCS (suero fetal bovino), indujo procesos significativamente más extensos (p < 0.05), que derivaron en cordones multicelulares. Asimismo, el HA provocó un aumento significativo (p < 0.005) en el número de células y colonias en cultivos que crecían en presencia de HGF, FCS y medio libre de suero. Por otra parte, en los cultivos tridimensionales, el HA promovió la supervivencia de células de la UB luego de 5 días de cultivo (menor número de núcleos marcados con el homodímero de etidio), respecto del control que crecía sólo en colágeno tipo I.

Es importante destacar que los efectos observados fueron provocados por la interacción de HA con el receptor CD44, ya que el bloqueo de este último con el anticuerpo KM 201 produjo una reducción significativa (p < 0.00002) en el número de células y colonias con procesos luego de 5 días de cultivo con BSN-CM. Dicha reducción se observó, asimismo, en presencia de la enzima que degrada al HA (Streptomyces hyaluronidase), (p < 0.00001). En ambos tratamientos la inhibición de la señalización del HA por CD44 fue dependiente de la concentración del anticuerpo y la dosis de la enzima utilizadas. Por otra parte, la importancia de esta vía de señalización se comprobó en los cultivos tridimensionales en geles con colágeno tipo I, en donde en presencia de factores que promovían la ramificación de procesos (BSN-MC, FCS y HA), la transcripción de CD44 era mayor, respecto de la observada con el medio DMEM/F12 libre de suero. En este sentido, la expresión de CD44 inducida por HA fue superior a la observada en las demás condiciones de cultivo. Por otra parte, tanto las células de la UB como las BSN expresaron Has 1 y Has 2, siendo Has 2 expresada, asimismo, en la UB y el MM de riñones de embriones de rata de 13 días.

Con respecto a la expresión de CD44 en cultivos tridimensionales detectada por inmunohistoquímica, se pudo observar que ésta se ubicaba en los extremos de los procesos (parte distal) de las células de la UB y en un patrón granular en la membrana plasmática del cuerpo celular (en dicha ubicación estos receptores podrían ser los mediadores del HA en la activación de mecanismos que regulan la supervivencia celular). La localización de CD44 en los extremos de los procesos favorece su interacción con los componentes de la MEC (en particular, la señalización por HA implicada en la génesis de los procesos).

Asimismo, en secciones de riñón de embriones de ratón de 13 días, la expresión del HA se encontró en las proximidades de la superficie celular basal en los túbulos colectores en desarrollo, correspondiendo con la localización basolateral del receptor CD44 en las células de dichos túbulos.

Con respecto a la expresión génica detectada por los arreglos, el HA indujo un incremento del 75% en la señal de 14 de los 133 genes que se expresaban en células de la UB crecidas en la matriz con colágeno tipo I. Los genes, cuya expresión se encontraba aumentada, regulan procesos de proliferación, supervivencia y morfogénesis.

Discusión

El HA no sólo es un componente esencial en la estructura de la MEC, sino que promueve la proliferación, la supervivencia de células de la UB y la extensión de sus procesos mediante la interacción con su receptor CD44. El efecto del HA en los procesos se comprueba por la expresión significativa de CD44 en los extremos de éstos y la inhibición del desarrollo de estas estructuras por la utilización de un anticuerpo bloqueante de CD44 o de la enzima que degrada al HA. Por otra parte, los experimentos in vivo permiten determinar la implicancia del HA en la génesis de la ramificación, por su proximidad con el receptor CD44 en las células de la UB.

Se ha postulado que el aumento en la concentración del HA en los extremos de los procesos podría inducir en éstos, un incremento en la localización plasmática del receptor CD44. De esta manera, CD44 induciría cambios en el citoesqueleto de actina, mediante su interacción con el complejo ERM (ezrin/radixin/moesin), el cual está implicado en la organización de las moléculas de adhesión en la superficie celular y por ende, la formación de procesos. Esto permitiría la remodelación del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática y de la superficie celular para producir las ramificaciones en los procesos. Dicha reorganización se comprueba en la formación de lamelipodios en células epiteliales de mama, los cuales pueden ser inducidos por la adición del HA e inhibidos por el bloqueo del receptor CD44.

Con respecto a la detección de la expresión de múltiples genes en los arreglos, el HA indujo un aumento en genes reguladores de la proliferación, supervivencia y apoptosis (c-Myc-related transcription factor, PCNA [antígeno nuclear de células en proliferación], BAG-1 [Bcl-2 associated athanogene], BID [BH3 interacting-domain death agonist] y Grp78 [glucose-regulated protein 78 Kda]) y morfogénesis e interacciones de la célula con la MEC (MMP-11 [Stromelysin-3 matrix metalloproteinase-11], integrina alfa 7, CD44,NF2 [Neurofibromin 2]).

Conclusión

La ramificación del sistema tubular metanéfrico, a partir de la UB y del MM, es promovida por los efectos que ejerce el HA en la viabilidad y proliferación celular y en el crecimiento de los procesos. Este mecanismo se caracteriza por presentar una retroalimentación positiva, en la cual el depósito de HA induce una mayor expresión del receptor CD44 en la superficie celular, en los extremos de los procesos, y activa la expresión de genes implicados en la supervivencia, proliferación celular y morfogénesis. Asimismo, aumenta la expresión de los genes que codifican para las proteínas CD44 y las que forman parte del complejo ERM, el cual es esencial en la restructuración del citoesqueleto en la formación del proceso inducida por HA y mediada por CD44.

Especialidad: Clínica Médica