Posibles Explicaciones de los Efectos Antiinflamatorios y Antiangiogénicos de las Estatinas

• AUTOR : Massaro M, Zampolli A, De Caterina R y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Statins Inhibit Cyclooxygenase-2 and Matrix Metalloproteinase-9 in Human Endothelial Cells: Anti-Angiogenic Actions Possibly Contributing to Plaque Stability
• CITA : Cardiovascular Research 86(2):311-320, May 2010
• MICRO : Mediante la inhibición de la ciclooxigenasa-2 y las metaloproteinasas-9, las estatinas logran un efecto antiangiogénico, con lo cual reducen la posibilidad de inestabilidad de las placas de aterosclerosis.

Introducción

Actualmente, las estatinas son el tratamiento de elección para la dislipidemia. Actúan mediante la inhibición competitiva de la HMG-CoA-reductasa. Sin embargo, se ha sugerido que su influencia favorable sobre el riesgo cardiovascular, más allá de su capacidad hipolipemiante, parece deberse a su participación en los fenómenos inflamatorios y proliferativos asociados con la aterosclerosis, al evitar la síntesis de isoprenoides intermedios, como el farnesilpirofosfato (Fpp) y el geranil-geranilpirofosfato (GGpp). Esto podría inhibir la modificación lipídica translacional y la activación de algunas pequeñas proteínas G -entre ellas, Ras y Rho- involucradas en la señalización de las células eucarióticas.

Las estatinas pueden promover la formación de vasos colaterales en los tejidos isquémicos y también impedir la angiogénesis; aparentemente, esto depende de la dosis y del ambiente (hipoxia o inflamación). Las dosis bajas estimularían la angiogénesis, y las altas la inhibirían.

La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una enzima proinflamatoria con efectos proangiogénicos, y su activación se relacionaría con la liberación de metaloproteinasas (MP), tal como se observó en modelos celulares, aunque no endoteliales.

La activación de COX-2 se relaciona además con las vías dependientes de Ras y Rho, blancos potenciales de las estatinas; por ello, los autores de este artículo intentaron caracterizar los efectos antiangiogénicos de estos fármacos en relación con la COX-2 y las MP, mediante ensayos angiogénicos in vitro.

Métodos

Se recolectaron células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (CEHVU) y de la vena safena, y células endoteliales bovinas derivadas de la aorta. Los experimentos descriptos se llevaron a cabo con las primeras; los experimentos de control, realizados con las demás, arrojaron resultados similares, salvo aclaración en contrario. Se agregó simvastatina (SIM) y atorvastatina (ATV) (0.001-10 µmol/l) en los medios con monocapas endoteliales confluentes 12 horas antes de la estimulación con acetato de miristato forbol (AMF, 10 nmol/l) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa, 10 ng/ml). En los experimentos adicionales, se agregó mevalonato, Fpp, GGpp y colesterol, para evaluar los efectos de las estatinas en la vía del mevalonato. Para confirmar el papel de los isoprenoides intermedios en esta vía, se agregaron al medio el inhibidor de la farnesiltransferasa (FPT), el inhibidor de la geranil-geraniltransferasa (GGT), denominado GGTI-286, y la transferasa C3, inhibidora de Rho.

Luego del tratamiento con los fármacos y la estimulación, se lavaron las monocapas, se lisaron y se procesaron. En algunos experimentos, se utilizaron anticuerpos monoclonales contra la COX-1, contra la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS), o ambos. También se determinó la concentración de 6-ceto-PGF_1alfa, el producto estable del catabolismo no enzimático de la prostaciclina. Se usaron además técnicas de Northern blot y zimografía en gelatina, se cuantificó la producción de MP y la actividad de la Rho-quinasa.

La formación de estructuras similares a las vasculares por las CEHVU se evaluó en la membrana basal de gel Matrigel®. Las CEHVU se cultivaron hasta lograr un 80% de confluencia y luego se trataron con SIM, con isoprenoides intermedios o sin ellos; a las 12 horas, las células se desprendieron con tripsina y EDTA al 0.25%, se cuantificaron, se resuspendieron en suero y se cuantificaron nuevamente. Mientras tanto, se aplicó Matrigel® a placas de cultivo. Se analizaron los resultados del agregado de AMF (con SIM o sin ella), isoprenoides o NS-398 (inhibidor de la actividad de COX-2), y se evaluó la formación de estructuras tubulares, como expresión de angiogénesis.

Los resultados se expresan en promedios ± desviaciones estándar.

Resultados

Las estatinas inhiben la expresión de COX-2 inducida por estímulos mitógenos e inflamatorios

La expresión de COX-2 se redujo en las CEHVU tratadas con SIM y estimuladas con AMF; el efecto máximo se observó con concentraciones de 10 µmol/l (-70 ± 10%; p < 0.01), sin cambios significativos en la de COX-1. El efecto de la SIM dependió de la dosis y del tiempo. La concentración inhibitoria de 50% fue de 1 µmol/l, valor similar a los niveles plasmáticos alcanzados in vivo, por lo que se usó este valor para los experimentos posteriores. Los resultados con ATV y la estimulación con TNF-alfa fueron similares.

La inhibición de la expresión de COX-2 inducida por AMF y TNF-alfa y provocada por ambas estatinas se acompañó de una reducción de la actividad de la enzima (más notable con SIM), demostrada por las concentraciones observadas de 6-ceto-PGF_1alfa. Los análisis de Northern arrojaron resultados comparables, lo que indica un efecto pretranslacional en la regulación de la COX-2.

Los autores también hallaron que ambas estatinas lograron aumentar la expresión basal de eNOS y revertir el descenso inducido por TNF-alfa. Para excluir la posibilidad de que los efectos de la SIM sobre la expresión de COX-2 estuviesen mediados por el incremento de la producción de óxido nítrico, se expusieron células tratadas con la estatina a un inhibidor de la eNOS (L-NAME), lo que no modificó los resultados.

El mevalonato y el GGpp revierten la inhibición de la expresión de COX-2 inducida por simvastatina, no así el Fpp

La reducción de la expresión de COX-2 se revirtió con mevalonato, pero no con colesterol, lo cual sugiere que no es este último, sino los isoprenoides intermedios, los que participan de la regulación de la expresión de COX-2 por estatinas. El GGpp también logró esa reversión, lo cual indica que la inhibición de la geranilgeranilación participa del proceso, pero no la de la farnesilación. Esto se confirmó al observar que el agregado de un inhibidor de FPT no generaba los mismos efectos que la SIM, pero el de un inhibidor de GGT (GGTI-286) sí.

Las proteínas similares a Ras son posibles blancos terapéuticos de la simvastatina

Los isoprenoides intermedios son importantes sitios de acoplamiento de lípidos para las modificaciones postranslacionales y la traslocación de membrana de diversas proteínas, entre ellas, la pequeña proteína Ras ligadora de GGT y las similares a Ras (Rho, Rab, Rac, Ral y Rap). Como la pequeña proteína Rho ligadora de GGT participa en la vía mitógena que produce la expresión de COX-2, los autores plantearon que Rho podría ser un blanco específico de la SIM. Para demostrarlo, trataron las CEHVU con la transferasa C3 inhibidora de la Rho A/B/C y encontraron que reproducía los efectos de la estatina, al reducir significativamente la expresión de COX-2 inducida por AMF. El agregado de GGpp no revirtió ese efecto. Luego evaluaron la acción de SIM sobre la actividad de la Rho-quinasa y vieron que las mismas concentraciones de SIM capaces de reducir la expresión de COX-2 inducida por AMF redujeron dicha actividad (39 ± 15%; p < 0.01).

La simvastatina reduce la actividad angiogénica endotelial

Los autores evaluaron el impacto funcional de los efectos de la SIM en la expresión de COX-2 en relación con la actividad angiogénica endotelial mediante las pruebas en Matrigel®, y observaron la inhibición de diversos índices de formación tubular (como la longitud y la cantidad de bifurcaciones). Aquí también se vio que el agregado de mevalonato y GGpp revirtió el efecto de la estatina, no así el de Fpp. En iguales condiciones, el agregado de un inhibidor de la actividad de COX-2, NS-398, logró los mismos resultados en menor medida, lo que confirma la participación de la COX-2 en la angiogénesis.

Dado que la degradación de la membrana basal de Matrigel® por las enzimas proteolíticas como las MP es necesaria para la angiogénesis, y la actividad de COX-2 se ha involucrado en la expresión de las MP, los autores analizaron las acciones de la SIM y de la actividad de COX-2 en la regulación de las MP en las células de la vena umbilical y de la aorta, y comprobaron que la estatina, antes de la estimulación con AMF, redujo selectivamente la liberación de MP-9 (-40 ± 10% por zimografía; p < 0.01, y -39 ± 5% con 10 µmol/l de SIM por inmunoensayo enzimático; p < 0.01).

Luego se evaluó el efecto de NS-398 en la liberación de MP estimulada por AMF; su agregado al medio de cultivo 30 minutos antes de la estimulación redujo selectivamente la producción de MP-9. Para descartar que el efecto inhibitorio de NS-398 y SIM se debiera a una interferencia de la activación de la MP-9 más que de su liberación extracelular, se estimularon las CEHVU durante 24 horas con AMF, y luego se recolectaron y dividieron en alícuotas, a las que se agregaron concentraciones crecientes de SIM (0.1-10 µmol/l) o NS-398 (0.1-10 µmol/l); sin embargo no se detectaron efectos significativos sobre la actividad de MP-9 con ninguno de ellos.

No se vio reversión del efecto de NS-398 con el agregado de PGE₂ y carboprostaciclina (un análogo de PGI₂), lo que sugiere la participación de los metabolitos de COX-2 en el nexo funcional entre la actividad de COX-2 y la producción endotelial de MP-9.

Discusión

Existen pruebas de los beneficios de las estatinas en términos de riesgo cardiovascular, que parecen independientes de sus efectos hipolipemiantes. Estos beneficios podrían estar relacionados con las acciones de las estatinas en la expresión de genes proinflamatorios y proaterogénicos.

Este trabajo mostró que dos estatinas lipofílicas, SIM y ATV, se asociaron con claros aumentos de la expresión de eNOS, y con inhibición del potencial angiogénico endotelial y de la expresión estimulada de COX-2 y MP-9. Para esa estimulación, se usaron un elemento proangiogénico y otro proinflamatorio: AMF y TNF-alfa, respectivamente. La estatina redujo la expresión de COX-2 y la actividad angiogénica. Los autores demostraron que el inhibidor específico de COX-2, NS-398, logró el mismo efecto y redujo la liberación de MP-9, lo que constituye el primer indicio de un nexo funcional entre la actividad de COX-2 y la secreción endotelial de MP-9.

El hecho de que el mevalonato, producto intermedio de la HMG-CoA reductasa, revirtiera los efectos de la estatina sobre la COX-2 y la MP-9, demuestra que dichos efectos se deben a la capacidad de la SIM de reducir la cantidad de isoprenoides intermedios más que al colesterol celular.

El agregado de GGpp también atenuó estos efectos, al interferir con la geranilgeranilación de algunas proteínas, probablemente pertenecientes a la subfamilia

monomérica de geranil-geraniltransferasas (Rho A, Rho B, Rho C, Rac1, Rac2 y Cdc42), que participan en la regulación de la expresión genética de COX-2 y MP-9. Es por ello que un inhibidor de la GGpp, pero no de la Fpp, logró efectos similares a la estatina sobre la expresión de COX-2.

El hecho de que el agregado del inhibidor de Rho tuviera efectos similares a los de SIM respecto de la expresión de COX-2 corrobora su participación en la inducción endotelial de COX-2 por el mitógeno AMF, lo que se había sugerido en otros trabajos con agentes proinflamatorios, como AMF y TNF-alfa. También se había señalado una participación de la Fpp, pero no pudo ser demostrada por los autores.

Estos resultados amplían la información proporcionada por otros trabajos respecto de la capacidad de las estatinas de reducir la expresión de COX-2 inducida por mitógenos.

Si bien el papel de la actividad de la COX-2 endotelial en la inflamación y la aterogénesis es aún motivo de debate, hay experimentos en ratas deficitarias en receptores de apolipoproteina E y de lipoproteínas de baja densidad que demuestran que dicha actividad promueve la aterogénesis, pese a una inhibición selectiva de prostaciclina, y respalda los beneficios de una disminución de la actividad de COX-2 hallados en pacientes de alto riesgo ya tratados con aspirina. Por otro lado, se sugirió el papel de la angiogénesis, con la participación de la COX-2 y la liberación de MP-9, en la aparición e inestabilidad de las placas ateroscleróticas, de allí la importancia de los resultados presentados.

Si bien tanto la SIM como la ATV redujeron la expresión estimulada de COX-2, el efecto de la SIM fue mayor, lo que podría explicarse por diferencias en la solubilidad de ambos compuestos, aunque otros autores señalaron que puede deberse a su mayor capacidad antioxidante.

Los autores consideran demostrado que las estatinas reducen la expresión de COX-2 y la liberación de MP-9 en las células endoteliales humanas. También identificaron un nexo funcional entre la actividad de COX-2 y la liberación de MP-9, y señalaron que la inhibición de la geranilgeranilación sería el blanco principal de las estatinas para sus efectos. Estos resultados respaldan los beneficios antiinflamatorios y antiangiogénicos de estos fármacos.

Especialidad: Bibliografía - Cardiología