Producción en Gran Escala de Medicamentos Biotecnológicos

• AUTOR : Shukla A, Wolfe L, Mostafa S, Norman C
• TITULO ORIGINAL : Evolving Trends in mAb Production Processes
• CITA : Bioengineering & Translational Medicine 2(1):58-69, Abr 2017
• MICRO : Los anticuerpos monoclonales son una modalidad terapéutica en aumento a nivel global, aunque requieren el desarrollo de sistemas de manufactura robustos.

Introducción

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son medicamentos biofarmacéuticos muy exitosos en la actualidad, con más de 50 representantes en el mercado y una expectativa de ventas de 125 mil millones de dólares para el año 2020. Su mecanismo de acción se basa en la capacidad de unirse, con elevada especificidad y afinidad, a blancos terapéuticos específicos; la relativa facilidad de desarrollo para obtener moléculas humanas o humanizadas ha llevado a que existan en la actualidad más de 300 mAb en desarrollo. Son empleados principalmente en oncología y enfermedades autoinmunes o infrecuentes.

Es clave el desarrollo de procesos de manufactura robustos para la producción de estas moléculas, tanto para estudios clínicos como para la comercialización. Sin embargo, es necesario tener en cuenta factores como la escalabilidad, la robustez, la remoción de impurezas y la reproducibilidad; por estos factores es que los procesos de desarrollo en laboratorio difieren de los empleados para producción a gran escala.

Por este motivo, las compañías farmacéuticas han optado por enfoques de plataforma para el desarrollo de procesos de manufactura de mAb a gran escala. Estas plataformas permiten que, en menos de un año, el proyecto avance desde la secuencia genética hasta la producción de proteínas aptas para su uso en seres humanos; además, permiten que los sectores de producción y control de calidad empleen un marco que reduce el tiempo de análisis y producción.

El empleo de un sistema de expresión de proteínas en células de mamífero permite el desarrollo de líneas celulares estables muy rápidamente, y estos lotes alimentados por cultivos permiten el escalado a grandes volúmenes de producción. Sin embargo, las divergencias principales entre los métodos de producción se producen en los pasos corriente abajo (downstream), dado que cada proteína tiene impurezas específicas. La región Fc de los mAb suele tener secuencias de la proteína A de Staphylococcus aureus, la cual es empleada como ligando de cromatografía de afinidad en el paso de purificación. El desafío sobreviene en la remoción de impurezas, como ADN viral y del vector, y agregados de alto peso molecular.

Si bien el enfoque de plataforma genérico ha sido empleado exitosamente, existen algunas tendencias que deben ser tenidas en cuenta: la aparición de biosimilares, la manufactura a nivel global, las tecnologías de producción de un único uso, el aumento en las concentraciones de mAb de los cultivos, las nuevas tecnologías de purificación cromatográficas y no cromatográficas y el desarrollo de anticuerpos novedosos. En este último aspecto cabe destacar el desarrollo de anticuerpos fusionados con proteína Fc, que se unen al receptor de Fc neonatal y, de esta manera, tienen una vida media superior; el desarrollo de anticuerpos biespecíficos capaces de ligarse de forma simultánea con dos antígenos distintos o dos epitopes distintos sobre el mismo antígeno, y la aparición de complejos de mAb-fármaco empleados en el tratamiento de distintos tumores.

Plataformas de procesos de corriente arriba y corriente abajo para la producción de mAb

Las plataformas de producción tienen algunas características en común: los mAb son secretados al medio extracelular durante el cultivo y son recuperados por centrifugación y filtración por filtro de membrana, seguido por cromatografía de afinidad con proteína A, aunque se han desarrollado procesos independientes de este paso. Luego, se inactiva el ADN viral mediante incubación a pH bajo y filtración a través de un filtro de grado parvoviral.

Las diferencias principales entre las distintas plataformas se encuentran en los pasos de pulido cromatográfico del producto, y cada compañía desarrolla su plataforma sobre la base del sistema de expresión y los procesos de cultivos celulares, así como el tipo de mAb producido. El criterio principal es que la plataforma sea robusta y pueda emplearse en gran cantidad de moléculas, sin modificaciones significativas.

Existen algunas plataformas de empleo reciente. Algunas compañías han revelado su plataforma de procesos corriente abajo, con pasos típicos como la elución de proteína A. Sin embargo, los pasos de pulido se realizan mediante la cromatografía de intercambio catiónico (CEX, cation-exchange chromatography), seguido de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, hydrophobic interaction chromatography) en caso de existir agregados de alto peso molecular, o de cromatografía de intercambio aniónico (AEX, anion-exchange chromatography) en el caso de que fuera necesario remover proteínas del cultivo celular. Esta cromatografía es empleada también para la remoción de virus.

Por otro lado, otra compañía utiliza de forma rutinaria CEX y AEX en sus procesos corriente abajo; la primera es empleada en el primer paso de pulido, seguido de la segunda. Los mAb suelen ser básicos y se unen fuertemente a las resinas de la CEX, por lo que este procedimiento se emplea para remover proteínas del huésped. Sin embargo, es necesario el uso de recipientes de gran volumen para tener el soporte de AEX, dado que este paso requiere una conductividad baja para purificar el mAb de manera eficaz.

Este paso no es eficaz para la remoción de agregados de alto peso molecular, por lo que se ha desarrollado un método de AEX en modo de partición débil, en la cual el mAb es retenido levemente en el soporte.

Ambos métodos requieren que el material de carga de las columnas se encuentre diluido y, además, suele ser necesario un paso posterior con HIC para remover los agregados de peso molecular alto restantes; en este aspecto se han desarrollado métodos de operación bajo condiciones de sobrecarga sin agregado de sales, lo que permite una producción de gran cantidad de mAb. Dos compañías han creado métodos similares.

Más recientemente se ha incorporado la cromatografía multimodal, que consiste en la incorporación de residuos hidrófobos a los soportes de AEX y CEX para mejorar la purificación.

Tecnologías emergentes con posible impacto en la producción de mAb

Existen algunas tendencias tecnológicas que podrían tener un impacto positivo en la producción de mAb. Una de ellas es el desarrollo de procesos de manufactura continua similares a los empleados en la producción de moléculas pequeñas. El desarrollo de cultivos celulares en perfusión permite el agregado de medio de cultivo fresco mientras se retira el medio de cultivo con producto. Si bien esta modalidad se ha utilizado para la obtención de productos inestables o en bajo título, más recientemente se han implementado métodos con mejor productividad. El empleo de inóculos de alta densidad es posible debido al agregado constante de medio, aunque requiere volúmenes de cultivo altos.

Por otro lado, se han desarrollado métodos de cromatografía continua que permiten la titulación desde lotes hasta la manufactura continua de mAb. Las columnas clásicas pueden tener un diámetro máximo de 2 metros y una altura de hasta 30 cm; la combinación de varias columnas con un método de cultivo celular en perfusión permitiría obtener producto de forma continua y, así, reducir el capital necesario para la manufactura de mAb.

Un método de cromatografía continua potencialmente titulable es el empleo de cromatografía en contracorriente.

Otra área de potencial impacto son las separaciones no cromatográficas, mediante el uso de precipitaciones selectivas, floculación celular y separaciones bifásicas acuosas.

La precipitación selectiva consiste en precipitar los mAb con polímeros polianiones y las impurezas proteicas con ácido caprílico, entre otros métodos. Esto ahorraría pasos cromatográficos en el proceso corriente abajo.

La floculación del producto mediante pH bajo y agentes poliméricos no solo precipita a las células, sino también las impurezas y el ADN, lo que permite tanto la cosecha como también el pulido del producto.

Las separaciones bifásicas acuosas consisten en la creación de dos fases en solución mediante la mezcla de un polímero y sales o dos polímeros, como polietilenglicol-sal o polietilenglicol-dextrano. Se han informado separaciones altamente selectivas, aunque la dificultad de desarrollo de estos mecanismos y la falta de especificidad no permiten la aplicación para mAb en la actualidad.

Otra área de potencial impacto es la implementación de sistemas de expresión alternativos como células vegetales, Escherichia coli y levaduras. Sin embargo, los dos primeros sistemas tienen inconvenientes relacionados con el bajo rendimiento y la dificultad en la titulación de los cultivos. Escherichia coli carece de sistema de glucosilación, de modo que si la glucosilación es importante para la actividad del mAb, este sería un paso limitante. En la actualidad, E. coli se utiliza esencialmente como sistema de expresión para el rastreo de mAb.

En cambio, los sistemas de expresión en levaduras han sido empleados para la producción clínica de mAb. Se encuentra en desarrollo la producción a gran escala de mAb, expresados en la levadura Pichia pastoris, con buenos resultados en los rendimientos de producto.

Conclusiones

En la medida en que la productividad de los cultivos celulares continúe en aumento, serán necesarios otros formatos para mejorar la productividad de los procesos de corriente abajo. En esta tendencia se encuentra la operación de la cromatografía por afinidad de modo continuo, en vez del formato por lotes que se aplica en la actualidad. Las separaciones no cromatográficas, mediante precipitación o sistemas de dos fases acuosas (aqueous two-phase separations [ATPS], podrían extenderse en las plataformas de producción de mAb. Es de esperar que, en el futuro, estas plataformas continúen su evolución sobre la base de la mejora de la productividad y las nuevas moléculas que se desarrollen.

Ref : FARMA.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología