Relación entre la Acetil-L-Carnitina y el Metabolismo de la Proteína Precursora de Amiloide

• TITULO : Relación entre la Acetil-L-Carnitina y el Metabolismo de la Proteína Precursora de Amiloide
• AUTOR : Epis R, Marcello E, Di Luca M y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Modulatory Effect of Acetyl-L-Carnitine on Amyloid Precursor Protein Metabolism in Hippocampal Neurons
• CITA : European Journal of Pharmacology 597(1-3): 51-56, Nov 2008
• MICRO : La administración de acetil-L-carnitina se asocia con mayor liberación de proteína precursora de amiloide soluble alfa, metabolito característico de la vía no amiloidogénica, con mayor actividad de ADAM10.

Introducción

En la actualidad existen tratamientos eficaces para muchos cuadros neurológicos, pero la terapia farmacológica para la demencia, y especialmente la enfermedad de Alzheimer, sigue siendo un problema no resuelto. Los inhibidores de la colinesterasa se asociaron con mejoría considerable en la cognición y la función global, por lo que permiten controlar los síntomas de la enfermedad y, en parte, impactar las vías patogénicas a nivel molecular. Según la hipótesis del amiloide, la enfermedad de Alzheimer se debería a la acumulación progresiva de péptido amiloide beta, proteína neurotóxica, en placas amiloides que se conglomeran en el cerebro. La producción de cadenas de amiloide beta está mediada por las secretasas beta y gamma. La primera corta la proteína precursora de amiloide (PPA), y libera así la PPA soluble beta, fragmento que pasa al espacio extracelular, y un fragmento de 99 aminoácidos que queda unido a la membrana extracelular. Este último fragmento es luego cortado por la secretasa gamma, que libera así el fragmento amiloide beta.

La secretasa alfa (probablemente la metaloproteinasa ADAM10) es un protagonista importante de la vía metabólica de la PPA, dado que la corta en el segmento que corresponde a la proteína amiloide beta, lo que evita su formación. La ADAM10 corta la PPA y libera el fragmento PPA soluble alfa, neurotrófico, y el fragmento CTF83 que queda unido a la membrana y luego es cortado por la secretasa gamma. La ADAM10 actúa sobre la PPA cuando ambas se localizan en la membrana plasmática o en la vía secretoria, por lo que el transporte intracelular de esta metaloproteinasa podría ser un factor importante para modificar el procesamiento de la PPA hacia una vía no amiloidogénica. Recientemente, se informó que ADAM10 es transportada hacia la membrana por la proteína SAP97, parte de la familia MAGUK, y la primera es entregada hacia la densidad postsináptica principalmente por la activación de los receptores de N-metil-D-aspartato.

Estos mecanismos patogénicos están acompañados por otros procesos concomitantes, relacionados con la progresión de la enfermedad, como el estrés oxidativo y las alteraciones mitocondriales.

La acetil-L-carnitina (ALC) es un compuesto de la membrana mitocondrial que mantiene la energía de esta organela y reduce el estrés oxidativo asociado con el envejecimiento. Se encuentra presente en altas concentraciones en el cerebro y tiene varios efectos: por ejemplo, la carnitina es importante para la oxidación beta de los ácidos grasos, y la fracción de acetilo mantiene los niveles de acetil coenzima A. La ALC es especialmente activa en las neuronas colinérgicas, en las que se relaciona con la producción de acetilcolina, la estabilización de la membrana y la función mitocondrial adecuada. Es posible que exista un papel de este compuesto en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad en la que existen alteraciones en el sistema colinérgico, y en estudios controlados a doble ciego se observó un efecto beneficioso de la administración de ALC en pacientes con enfermedad de Alzheimer, fundamentalmente en estadios previos a la demencia. Se sabe que el pretratamiento de cultivos de neuronas corticales primarias con ALC atenúa considerablemente la citotoxicidad inducida por cadenas de amiloide beta, la oxidación proteica y la peroxidación de lípidos, en forma dependiente de la dosis. Además, la administración dietaria de este compuesto a ratones Tg2576 durante cuatro semanas se asoció con una reducción significativa de la producción de amiloide beta 40/42.

El objetivo del presente estudio fue determinar si el tratamiento con ALC es capaz de afectar mecanismos patogénicos de la enfermedad de Alzheimer, como la cascada amiloidea, en sistemas in vitro.

 

Materiales y métodos

Se realizaron cultivos celulares con células de neuroblastoma SH-SY5Y de seres humanos, y se introdujo ácido transretinoico durante varios días para diferenciar las células. Se utilizaron distintas concentraciones de ALC y un activador de la quinasa de proteínas C, enzima que se sabe que incrementa la tasa de corte de PPA por parte de la secretasa alfa. Para cada prueba se realizaron tres experimentos independientes en distintas placas que contenían el mismo número de células cada una. Se evaluó la morfología celular antes y luego de la diferenciación y el tratamiento.

Otro experimento consistió en realizar cultivos celulares de neuronas del hipocampo de ratas E19, y se trató estas células con ALC por 21 días in vitro. Se cuantificaron los niveles de PPA soluble alfa y se determinaron las concentraciones de ADAM10, SAP97, CTF99, CTF83, tubulina, PPA y la fracción insoluble Triton-X, además de la actividad de la colinesterasa, mediante protocolos estandarizados.

Para el análisis estadístico se utilizaron pruebas de la t de Student o análisis de varianza de una vía, con la prueba de Bonferroni.

 

Resultados

Con el fin de estimar el efecto de la exposición a ALC sobre el metabolismo de la PPA, se midió la concentración de PPA soluble alfa liberada al medio de cultivo por parte de las células de neuroblastoma, y se evaluó la diferenciación mediante el control de la actividad enzimática de la colinesterasa (que degrada la acetilcolina a nivel de la sinapsis). Estas células diferenciadas fueron cultivadas en presencia de 150 o 300 µM de ALC por dos y cuatro horas, o bien sin esta proteína, y se utilizaron pruebas de Western blot para cuantificar la PPA soluble alfa presente en el medio. Tras la exposición de 150 y 300 µM de ALC por dos horas no se observó modificación de la vía metabólica hacia formas no patogénicas, y se detectaron niveles aumentados, en forma no significativa, de PPA soluble alfa. Tras la exposición durante cuatro horas a estas dos concentraciones se observó que había significativamente mayor liberación de PPA soluble alfa (311.45 ± 15.4% y 248.71 ± 9.2% adicionales, respectivamente, en relación con el control; p < 0.05 para ambos). Estos resultados validan la utilidad de las células de neuroblastoma tratadas como un modelo adecuado para estos experimentos; el aumento de la PPA soluble alfa podría deberse al aumento en el precursor, PPA, o a mayor concentración o actividad de ADAM10. No se detectaron, mediante Western blot, diferencias significativas en los niveles de esta última enzima, ni en los de PPA, por lo que los autores postulan que el aumento de PPA soluble alfa podría deberse a la mayor actividad de ADAM10.

Estos resultados indican que la ALC podría favorecer el metabolismo no amiloidogénico de la PPA en una línea celular de neuroblastoma, sin afectar los niveles de PPA ni de ADAM10. A continuación, los autores incubaron neuronas primarias de hipocampo de ratas durante 21 días, con exposición a 150 µM de ALC durante dos horas. Se observó que el tratamiento con ALC se asoció significativamente con mayores niveles de tinción por inmunohistoquímica de ADAM10 (54.21 ± 14.7% adicional, p = 0.035 en comparación con el control) en la fracción insoluble Triton, sin afectar los niveles de la proteína en el homogeneizado. Estos resultados indican que la ALC no altera los niveles de proteína de ADAM10, sino que influye sobre el sistema de liberación de enzima a la membrana postsináptica, lo que provoca un aumento de la actividad enzimática. Para verificar que la cantidad de proteína era la misma, se determinaron los niveles de tubulina, tanto en el homogeneizado como en la fracción insoluble Triton por Western blot, y se observó que eran similares (p > 0.05 contra el control). Tampoco se detectaron diferencias en cuanto a los niveles de SAP97 en los homogeneizados ni en la fracción insoluble Triton (p > 0.05 contra el control).

Finalmente, se evaluó si el incremento de la actividad de ADAM10 en la fracción insoluble Triton se asociaba con mayor actividad de alfa secretasa, con determinación de los niveles de fragmentos terminales C de PPA, CTF99 (para cortes beta) y de CTF83 (para cortes alfa). Mediante análisis cuantitativo se halló que el tratamiento con ALC se asociaba con aumento significativo de la concentración de CTF83 (19.53 ± 9.9% adicional, p < 0.05 en comparación con el control), y reducción significativa de los niveles de CTF99 (13.8 ± 4.9% menor, p < 0.05 contra el control), y la razón entre CTF99 y CTF83 se redujo significativamente (27 ± 2.6% menor, p < 0.05 contra el control).

 

Conclusiones

El presente estudio demuestra que la ALC afecta la actividad de un componente fundamental en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer: la alfa secretasa. En células cultivadas de neuroblastoma, la ALC se asoció con mayor liberación de PPA soluble alfa, metabolito característico de la vía no amiloidogénica, lo que se correlacionó con su vez con mayor actividad ADAM10, sin modificar la concentración de esta enzima o la de SAP97.

Especialidad: Bibliografía - Neurología