Revisan la Actividad de las Monooxigenasas en el Metabolismo Procariota de Alcanos y Acidos Grasos

• AUTOR : Van Bogaert I, Groeneboer S, Saerens K, Soetaert W
• TITULO ORIGINAL : The Role of Cytochrome P450 Monooxygenases in Microbial Fatty Acid Metabolism
• CITA : FEBS Journal 278(2):206-221, Ene 2011
• MICRO : Se presenta una revisión acerca de la participación de las monooxigenasas en los procesos metabólicos de alcanos y ácidos grasos en los organismos procariotas.

 

Introducción

El sistema enzimático citocromo P450 está constituido por una amplia y divergente familia de enzimas. Se incluyen las hemotiolato-proteínas que presentan un bolsillo hidrófobo. Estas enzimas catalizan una reacción en la cual el oxígeno molecular se une con el hierro del grupo hemo, con activación previa a la transferencia de sustrato. El monóxido de carbono también puede unirse con el grupo hemo, dando lugar a un complejo inactivo con absorción máxima a los 450 nm (de allí el nombre de P450).

Las enzimas que conforman el sistema enzimático citocromo P450 han sido clasificadas en familias y subfamilias, en función de la homología no menor del 40% o 55% de los aminoácidos, en ese orden. En la nomenclatura internacional actual se reconocen más de 11 000 genes relacionados con el sistema enzimático citocromo P450. En este contexto, esta superfamilia de enzimas es muy divergente. Según datos de estudios filogenéticos, los ancestros unicelulares de los vegetales se caracterizaban por al menos 3 grandes grupos principales de estas enzimas. El llamado «grupo A» se asocia con la catálisis de procesos característicos del metabolismo vegetal, mientras que el «grupo no A» está integrado por 2 divisiones, una de las cuales comprende a las hidroxilasas de los ácidos grasos y el restante se vincula con esterol-oxidasas compartidas por animales, hongos y bacterias.

También, se señala que los ácidos grasos (AG) son moléculas simples e indispensables, incorporadas en los fosfolípidos como componente fundamental de las membranas biológicas. Asimismo, se los considera una fuente de carbono o energía, así como elementos constitutivos de moléculas complejas o de vías de señalización de procesos fisiológicos. La totalidad de estos procesos se vinculan con la participación de enzimas específicas, entre las que sobresalen las monooxigenasas del sistema enzimático citocromo P450 (M-P450), presentes en todos los organismos eucariotas y en una gran proporción de las células procariotas. Se han identificado más de 3 800 variantes de M-P450 de origen bacteriano, de las cuales del 10% al 17% utilizan a los AG como sustrato. Además de sus diversas funciones fisiológicas, las M-P450 difieren en la posición en la que generan hidroxilación (grupo carboxilo, en la cadena de carbonos o el extremo terminal o subterminal).

Metabolismo de los AG

Los diversos microorganismos pueden degradar casi todos los compuestos orgánicos. Incluso los alcanos, considerados desde el punto de vista químico como moléculas inertes, pueden ser degradados y empleados como fuente de carbono tanto por las bacterias como por los hongos. La asimilación aeróbica de los alcanos se inicia mediante la hidroxilación terminal, con posterior transformación en un aldehído y luego en un AG, el cual ingresa a la vía de la beta-oxidación. La primera hidroxilasa de alcanos (G-PO1) fue identificada en Pseudomona putida, aunque en la actualidad se han reconocido genes relacionados en una gran variedad de bacterias. Las enzimas correspondientes en las levaduras no se vinculan con las hidroxilasas bacterianas, sino que forman parte de la familia CYP52 de las M-P450. Se reconocen al menos 18 genes que codifican a estas enzimas en Candida tropicalis, C. maltosa y Yarrowia lipolytica. Cinco genes son inducidos por la presencia de octadecanos (CYP52A12, -13, -14, -17 y -18), sin trascripción reconocible para CYP52A15, -16, -19, -20 y D2 en distintas condiciones. Las distintas enzimas difieren en la especificidad para cada sustrato en términos de la longitud de la cadena de carbonos, lo que se considera un motivo para existencia de múltiples genes en un mismo organismo. Si bien la inducción de estos genes (alk1, -2, -3 y -5) en respuesta a la presencia de N-alcanos o AG es frecuente en estas levaduras, no se han identificado los mecanismos moleculares subyacentes. Se ha postulado que, en presencia de alcanos, 2 proteínas helicoidales (Yas1p y Yas2p) conforman heterodímeros con capacidad de unión con el denominado «elemento de respuesta» a los alcanos en el promotor del gen alk1. El complejo de proteínas parece unirse, igualmente, con otros promotores que interfieren en la degradación de los alcanos, así como con el propio gen Yas1 para dar lugar a un mecanismo de retroalimentación con autorregulación.

Los autores indican que se ha subestimado la participación de las M-P450 en el metabolismo bacteriano de los octanos y que se ha clonado a la enzima P450alk en especies como Acinetobacter calcoaceticus, Sphingomonas spp y Mycobacterium spp. La mayoría de los microorganismos alcanótrofos atacan sustratos variados o mixtos con diferentes enzimas, según se ve reflejado en las variaciones tanto de los genes CYP52 en las levaduras como de las hidroxilasas de alcanos en las bacterias. Se describe, además, una tendencia similar en las enzimas bacterianas P450alk. Se destaca que Alcanivorax borkumensis sintetiza 2 hidroxilasas de alcanos y 2 isoenzimas CYP153. Este microorganismo es predominante en las aguas contaminadas por petróleo, debido a su capacidad amplia y eficaz para la degradación de los hidrocarburos.

Los alcanos son componentes habituales de distintas barreras naturales en los vegetales y los insectos. Las cutículas vegetales contienen cutina, un polímero conformado por ésteres y puentes epóxido de omega-hidroxi-AG. La presencia de enzimas para degradación de los alcanos es una herramienta de los microorganismos para invadir las barreras defensivas de los vegetales, al tiempo que permiten la utilización de los AG como fuente de energía. En cambio, la cutícula de los insectos está constituida por proteínas y quitina, con una epicutícula externa integrada por lípidos. El hongo parásito Metarhizium anisopliae puede infectar a distintos insectos mediante la penetración de la cutícula, por lo cual podría emplearse como control de plagas. Los análisis genéticos permitieron reconocer que la exposición a extractos de la cutícula induce la regulación en aumento de una M-P450 en las primeras horas de la incubación. De acuerdo con la clasificación internacional, esta enzima forma parte del grupo de las CYP52.

Si bien las M-P450 no intervienen en la degradación de los AG o en el proceso de beta-oxidación, se describe su participación en pasos metabólicos previos. De todos modos, las mismas enzimas que inducen oxidación terminal de los alcanos pueden provocar oxidación subterminal, con formación de alcoholes secundarios que se oxidan para formar cetonas. La acción de las monooxigenasas de Baeyer-Villiger convierte a estas moléculas en ésteres, los cuales son degradados en un alcohol primario y un AG. Estos AG comunes pueden oxidarse a nivel terminal por intervención de las M-P450, con ulterior transformación en ácidos dicarboxílicos que ingresan al ciclo de la beta-oxidación. Las enzimas micóticas del grupo CYP52 se caracterizan por su versatilidad, ya que las diversas isoformas se asocian con distintos niveles de actividad sobre los alcanos. Cada variante individual se relaciona con un sustrato específico en virtud de la longitud de la cadena de carbonos, con preferencia ya sea por un alcano o un AG. Se asume que la prevalencia de los diversos sistemas enzimáticos forma parte de la capacidad de los hongos para crecer de modo eficaz sobre la base de una variedad de alcanos y AG. Asimismo, se postula como otra ventaja de la vía de las M-P450 a la posibilidad de evitar la formación de peróxido de hidrógeno por acción de alcohol-AG oxidasa.

Si bien las enzimas que integran la familia CYP52 parecen asociadas en su totalidad con la hidroxilación de alcanos, AG o ambos, esta presunción se ha establecido sobre la base de la secuencia de aminoácidos; en consecuencia, algunas isoformas podrían ser parte de otros procesos biológicos no relacionados. Se advierte que la variante CYP52A21 podría formar parte de la generación de multirresistencia en el patógeno oportunista C. albicans.

Asimismo, los AG hidroxilados no sólo son productos intermedios del metabolismo, sino que son constituyentes de lípidos estructurales, como los esfingolípidos de las membranas celulares. Las enzimas que catalizan la síntesis de estas moléculas se describen también en hongos, bacterias e, incluso, en organismos anaerobios, como Sphingomonas paucimobilis. En estos casos, las enzimas emplean peróxido de hidrógeno en lugar de oxígeno, sin requerimientos equivalentes de reducción. Esta enzima es muy específica para los AG y no actúa sobre los alcanos.

Biosurfactantes

Estas moléculas son compuestos que pueden reducir la tensión entre fases líquidas como consecuencia de sus propiedades anfifílicas. Estos productos contienen un componente hidrófilo y otro hidrófobo que interactúan con las distintas fases de los sistemas heterogéneos. Los AG comunes o los originados en la beta-oxidación se integran a la porción hidrófoba, si bien en ciertos casos, son los AG hidroxilados por la actividad de las M-P450 los que desempeñan ese papel, como sucede con los celobiósidos producidos por algunas levaduras. Se señala que las enzimas de la familia CYP1 catalizan la conversión de ácido palmítico en ácido junipérico; este proceso involucra una hidroxilación terminal fundamental para la unión covalente entre el AG hidroxilado y el celobiósido.

Los soforolípidos representan otra forma de AG hidroxilados que actúan como biosurfactantes, dada la presencia de una hidroxilación en posición omega u omega-1. Estos AG modificados se describen en especies de Candida, las cuales expresan enzimas específicas de la familia CYP52.

Policétidos

Estas moléculas se definen como metabolitos secundarios de distintos organismos y se originan en la polimerización de acetilo y propionilo en un proceso comparable al de la síntesis de AG. Los mecanismos de hidroxilación se encuentran mediados por M-P450. Uno de los policétidos vinculado estructuralmente con los AG es la fumonisina, una micotoxina producida por especies del género Fusarium, que infectan al maíz y otros granos. Esta molécula se asocia con escasa toxicidad aguda, pero se desconocen los resultados de la exposición a dosis bajas a largo plazo y se han postulado presuntos efectos carcinógenos. La síntesis de esta molécula se atribuye a la acción de algunas isoenzimas del sistema enzimático citocromo P450, como la FUM6 (CYP505), que consiste en una M-P450 autosuficiente.

Asimismo, los antifúngicos secretados por los actinomicetos saprófitos representan otra variedad de policétidos bacterianos. Entre estos productos se destacan la nistatina, elaborada por Streptomyces noursei y comercializada como antimicótico. La estructura molecular de la nistatina corresponde a un anillo de macrolactona que es posteriormente modificado por las isoenzimas del sistema enzimático citocromo P450. La anfotericina, producida por S. nodosum, se caracteriza por una estructura molecular similar y se asocia con actividad sobre hongos, parásitos e priones.

En relación con las oxilipinas, se trata de moléculas originadas por la oxidación de los AG insaturados. Se destaca que los leucotrienos y las prostaglandinas pertenecen a esta familia de lípidos. Las enzimas que dan lugar a la formación de oxilipinas son muy diversas; la mayoría de las lipooxigenasas son, en realidad, proteínas que no contienen grupos hemo. En especies micóticas, como Aspergillus nidulans, las oxilipinas participan en la regulación de los ciclos sexual y asexual, así como del metabolismo secundario y de la colonización de potenciales hospederos vegetales. Estas oxilipinas se denominan «inductores sexuales precoces» (factores PSI [precocious sexual inducers]) y se originan a partir de AG insaturados de 18 carbonos. Entre las enzimas relacionadas con la biosíntesis de factores PSI se destacan la PPOA y la PPOC (CYP1006C1). Además, se han descrito oxilipinas bacterianas que parecen formar parte de las respuestas al estrés y de las interacciones entre patógenos y hospederos. La mayoría de estas enzimas de origen bacteriano son proteínas sin grupos hemo, si bien se han aislado compuestos similares a la CYP74 vegetales en algunas rizobacterias.

M-P450 sin función definida

Las M-P450 suelen obtener los electrones necesarios para su actividad por medio de uno o dos cofactores de oxidorreducción. La mayoría de las M-P450 eucariotas microsomales emplean sistemas rédox de clase II, con una cadena de transferencia de electrones asociada con la NADPH-citocromo P450 reductasa. Ambas enzimas presentan una región en el retículo endoplásmico y otro dominio en el citosol. La reductasa es una flavoproteína que transfiere el ión híbrido desde el NAPDH a una molécula con menor potencial rédox. Por el contrario, la mayoría de las M-P450 procariotas se localizan en el citosol e interactúan con 2 sistemas rédox diferentes, que incluyen una reductasa unida a NAPDH y una ferrodoxina o una flavodoxina. Estos sistemas rédox de clase I se caracterizan por su alta eficacia catalítica. Estas proteínas, como BM-3 (CYP102A1), son autosuficientes y solubles, por lo cual constituyen un modelo ideal para los estudios estructurales y de espectroscopia. De acuerdo con los resultados de distintas experiencias, se cita que BM-3 podría participar de la degradación oxidativa de los AG de cadena ramificada, con potenciales aplicaciones en biotecnología.

Igualmente, se reconocen algunas M-P450 que pueden actuar sobre los AG, aunque se encuentran relacionadas con proteínas que interactúan sobre sustratos diferentes. Entre otras, se mencionan a las isoenzimas CYP106A2, CYP105D5 y la variante termoestable CYP119A1 de origen bacteriano.

Conclusiones

La mayoría de las M-P450 puede catalizar reacciones de hidroxilación y, a pesar de que interactúan con esteroides o estructuras aromáticas, una fracción significativa de estas enzimas interviene sobre moléculas simples, como los AG y los alcanos. Las M-P450 logran activar los grupos metilo ubicados en posición terminal. Se reconoce duplicación de genes y eventos de conversión; en este contexto, las enzimas vinculadas con la hidroxilación de AG, alcanos o ambos permiten describir cómo distintas isoenzimas pueden degradar una gran cantidad de sustratos diferentes. Los autores postulan que aún restan descubrir variados procesos de hidroxilación mediados por M-P450 desconocidas o no caracterizadas.

Especialidad: Bibliografía - Farmacología