Se Describen los Efectos de Oxacilina y Tetracilina sobre la Autolisis en Staphylococcus aureus

• AUTOR : Wilkinson B, Jayaswal R, Ledala N
• TITULO ORIGINAL : Effects of Oxacillin and Tetracycline on Autolysis, Autolysin Processing and atl Transcription in Staphylococcus aureus
• CITA : International Journal of Antimicrobial Agents 27(6):518-524, Jun 2006
• MICRO : Las autolisinas son peptiglucano hidrolasas involucradas en el crecimiento y la muerte celular. Los autores investigaron los efectos de oxacilina, cloranfenicol y tetraciclinas sobre la autolisis, las características de las peptidoglucano hidrolasas y la transcripción de atl que codifica las principales autolisinas de Staphylococcus aureus.

Introducción

El tratamiento con antibióticos activos en la pared bacteriana conduce a la muerte y lisis de cepas de Staphylococcus aureus. La lisis se produce por la acción de autolisinas, enzimas peptidoglucano hidrolasas que degradan el polímero principal de la pared celular. Existen diversas peptidoglucano hidrolasas con diferentes especificidades de unión en S. aureus. La actividad de las hidrolasas se puede detectar por medio del gel de electroforesis que utiliza células muertas o la pared celular de bacterias grampositivas. El gen atl codifica una proteína bifuncional con dominios N-acetilmuramil-L-alanina (AM) y endo-beta-N-acetilglucosamida (GL) que generan, a través de procesos proteolíticos, enzimas AM y GL. Los productos genéticos de atl son los principales contribuyentes del perfil peptidoglucano hidrolasa de S. aureus.

Los antibióticos activos en la pared celular activan autolisinas celulares. Los autores evaluaron el efecto de estos antibióticos sobre los perfiles de autolisinas y peptidoglucanos en S. aureus meticilino sensible (SAMS) y resistente. La oxacilina provoca un importante cambio del perfil peptidoglucano hidrolasa en cepas sensibles de S. aureus.

Materiales y métodos

Los investigadores utilizaron diversas cepas de S. aureus (SH100, N315, COL, BB270, SH108, Lyt-) cultivadas en peptona, extracto de levadura y potasio-fosfato dibásico, hasta una densidad óptica de 600 nm (DO600) en 0.3, momento en el que se agregaró la concentración inhibitoria mínima de los antibióticos. Los controles se cultivaron hasta una DO580 = 0.7 y los antibióticos fueron incubados por el mismo período. Tritón X-100 indujo autolisis de las células.

Las células expuestas a los antibióticos, igual que las células control, fueron centrifugadas y lavadas con agua destilada. Luego, se congeló y descongeló el sedimento celular. Las células fueron removidas por centrifugación y el sobrenadante, considerado extracto del proceso de congelación y descongelación (freeze-thaw), representó las autolisinas ligadas a la pared celular. Las fracciones de autolisinas extracelulares del cultivo control y el tratado con antibiótico fueron obtenidas por centrifugación y concentración del sobrenadante.

Los autores obtuvieron los perfiles de peptidoglucano hidrolasas por zimografía, realizaron análisis de western blot con extractos de autolisinas, asilamiento del ARN y análisis de northern blot de la transcripción del gen atl. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el ensayo de Bradford.

Resultados

Las células provenientes de la cepa SH100 (SAMS) cultivadas con oxacilina tuvieron mayor índice de autolisinas en comparación con los controles; por su parte, las células cultivadas con inhibidores de la síntesis proteica como las tetraciclinas o con cloranfenicol tuvieron una autolisis menor en comparación con las células control. A pesar de que las células cultivadas con oxacilina tuvieron mayor autolisis que el control, los índices de mortalidad fueron similares cuando estuvieron suspendidas en una misma DO con Tritón X-100.

Los autores determinaron y compararon los modelos de peptidoglucano hidrolasas provenientes de los extractos de autolisinas freeze-thaw tratados con 1.2 µg/mLl de oxacilina durante 15, 30 y 60 minutos. Este tratamiento provocó un aumento de las peptidoglucano hidrolasas de alto peso molecular y una disminución de los principales peptidoglucanos de bajo peso molecular. Las células expuestas al cloranfenicol mostraron pocos cambios en el modelo de peptidoglucano hidrolasas. Los autores no pudieron determinar los modelos de peptidoglucano hidrolasas de las células tratadas con tetraciclinas pero observaron alteraciones en el patrón del extracto de estas enzimas tratado con oxacilina.

El gen atl codifica las proteínas AM, GL y un proceso proteolítico postranslacional importante para generar la curva de peptidoglucano hidrolasas. El análisis de las características de estas enzimas mediante inmunotransferencia mostró anticuerpos IgG anti-GL unidos a peptidoglucano hidrolasas de alto y bajo peso molecular, mientras que los anticuerpo IgG anti-AM sólo se unieron a los peptidoglucanos hidrolasas de alto peso molecular. Se desconoce la causa de esta diferencia.

Las distintas cepas de S. aureus presentaron diferentes sensibilidades a los antibióticos que se manifestó en el análisis zimográfico de autolisinas. Las cepas N315 y SH100 en presencia de oxacilina perdieron las principales peptidoglucanos hidrolasas de bajo peso molecular y aumentaron las de alto peso molecular. Sin embargo, en presencia de oxacilina, la cepa COL no mostró cambios. La cepa BB270 meticilino resistente no presentó la banda principal de peptidoglucano hidrolasa de bajo peso molecular. Por su parte, la cepa N315 meticilino sensible demostró autolisis reducida con la presencia de tetraciclina y cloranfenicol. Los cambios en las curvas de peptidoglucano hidrolasas en presencia de oxacilina fueron moderados para COL y BB270.

Con la presencia de oxacilina, la cepa mutante Lyt- generó un aumento leve de la autolisis, mientras que la cepa mutante del gen atl -SH108- mostró un incremento en las proteínas de alto peso molecular de las peptidoglucano hidrolasas.

La exposición de los cultivos a oxacilina condujo a un aumento en el índice de autolisis celular y un cambio en la curva de peptidoglucano hidrolasas. Los análisis de northern blot mostraron una disminución significativa en la expresión de atl en las cepas SH100 expuestas a oxacilina. Por lo tanto, el aumento en la autolisis de las cepas tratadas con oxacilina no se debe a la mayor expresión de atl.

Discusión

Los antibióticos que actúan en la pared celular desencadenan autolisis en bacterias susceptibles como S. aureus; sin embargo, la muerte celular que precede a la lisis y la autolisis inducida por penicilina se considera un suceso post mortem. Gierbrecht y colaboradores (1985) propusieron una fuerte unión entre la división celular y la inducción de lisis; sin embargo, no hay investigaciones concernientes a los cambios en las características celulares de peptidoglucano hidrolasas como respuesta al tratamiento antibiótico.

En esta investigación, los autores demostraron los cambios en las características de peptidoglucano hidrolasas con aumento en la autolisis de S. aureus tratadas con oxacilina.

Existe una evidencia significativa del papel de atl en la lisis de S. aureus inducida por penicilina y diversos trabajos apoyan esta descripción. Los autores encontraron modificaciones leves en las características de las peptidoglucano hidrolasas y autolisinas inducidas por oxacilina en cepas meticilino resistentes.

El tratamiento de S. aureus con inhibidores de la síntesis proteica como tetraciclina o cloranfenicol conduce a una disminución de autolisinas. Este agente produce un engrosamiento de la pared celular del S. aureus.

Los efectos de oxacilina y tetraciclinas sobre la transcripción de atl son opuestos. Las segundas aumentan la transcripción, mientras que oxaciclina la disminuye. La reducción de la transcripción es una estrategia bacteriana posible para preservar el peptidoglucano ante la presencia de agentes que aumentan la lisis.

Según los autores, son los primeros en notificar que la tetraciclina aumenta la transcripción de atl. Quizá la célula pueda detectar cambios estructurales del peptidoglucano o una disminución del potencial de autolisis, producto de un inhibidor de la síntesis proteica, y responda mediante un aumento de atl para combatirlo.

Por último, concluyen los expertos, la conocida lisis producida por los antibióticos beta lactámicos se acompañan de cambios en las características de peptidoglucano hidrolasas debido a una alteración en el proceso proteolítico que también forma parte del mecanismo de acción de estos antibióticos.

Especialidad: Bibliografía - Infectología