tilidad de la Biliverdina como Agente Antiviral en el Tratamiento de la Hepatitis C

• AUTOR : Zhu Z, Wilson A, Schmidt W y colaboradores
• TITULO ORIGINAL : Biliverdin Inhibits Hepatitis C Virus Nonstructural 3/4A Protease Activity: Mechanism for the Antiviral effects of Heme Oxygenase?
• CITA : Hepatology 52(6):1897-1905, Dic 2010
• MICRO : Los autores demostraron que la biliverdina es un agente antiviral potente, probablemente como consecuencia de su habilidad para inhibir de forma competitiva la actividad de la proteasa no estructural 3/4A del virus de la hepatitis C.

Introducción

El tratamiento estándar actual de la infección crónica por el virus de la hepatitis C (VHC), interferón-alfa pegilado y ribavirina, logra la erradicación viral en la mitad de los pacientes tratados, aproximadamente. El genoma de este virus consiste en ácido ribonucleico (ARN), contiene una proteasa activada por serina y una ARN polimerasa dependiente de ARN que son blancos importantes para el desarrollo de nuevas sustancias antivirales. Si bien los fármacos inhibidores de la proteasa y de la polimerasa prometen mejorar los resultados terapéuticos, la aparición rápida de resistencia viral podría limitar su eficacia.

El daño hepatocelular producido por el VHC está asociado con el estrés oxidativo, por lo que muchos autores se interesaron por el papel potencial de las enzimas antioxidantes como agentes citoprotectores durante la infección por este virus. La hemooxigenasa-1 (HO-1) es una enzima importante, que se activa oportunamente en respuesta a una variedad de agentes estresantes y citotoxinas. Esta enzima oxida el hemo a concentraciones equimolares de biliverdina (BV), monóxido de carbono y hierro. Luego de la oxidación del hemo, la biliverdina reductasa (BVR), abundante en el hepatocito, reduce rápidamente la BV libre a bilirrubina (BR).

Los autores del presente estudio, al igual que otros, demostraron que la inducción o sobreexpresión de la HO-1 en los replicones inhibe la replicación del VHC. Si bien se desconoce el mecanismo responsable, los investigadores infieren que uno o más productos de la reacción catalizada por la HO-1 podrían ser los responsables. Por ejemplo, el hierro inhibe la ARN polimerasa no estructural 5B mediante la inhibición de la unión de cationes divalentes.

El objetivo de los autores fue demostrar que la BV inhibe de forma potente la replicación viral a concentraciones marcadamente similares a las logradas luego de inducir con hemo la HO-1, lo que podría permitir sugerir que la BV es un agente antiviral primario liberado durante la oxidación del hemo. Además, el hecho de que los pigmentos biliares no conjugados inhiben las proteasas pancreáticas activadas por serina llevó a los autores a investigar los efectos de la BV y otros tetrapirroles sobre la proteasa no estructural 3/4A (NS3/4A) del VHC.

Métodos

Respecto de los materiales, se usó la ADN polimerasa y la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina. Las preparaciones de tetrapirroles eran de la mayor pureza disponible (99%). La preparación de isómeros de BR contenía un 93% de BR IX-alfa, 3% de BR III-alfa, 3% de BR XIII-alfa y trazas de isómeros beta y gamma. La BV se obtuvo mediante la oxidación de bilirrubina-alfa altamente purificada, seguida de la cristalización final en éter.

Se usó la línea celular de hepatoma humano (Huh5-15) con ARN subgenómico del VHC en replicación y los replicones Con1, que fueron inoculados con un clon infeccioso del VHC. También, se utilizaron las células Huh7.5 a las cuales se inoculó el clon J6/JFH del VHC. Todas las células se incubaron con BV, BR o FeCl2 durante 24 a 48 horas en el medio esencial modificado por Dulbecco, con 5% de suero fetal bovino.

Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en transcripción reversa, la tinción inmunocitoquímica con suero polivalente humano positivo para el VHC genotipo 2A para detectar los componentes virales presentes en las células y el análisis de Western blot con el mismo suero para reconocer de forma específica la proteína del core, NS3 y NS5A.

Se valoró por fluorometría la actividad de la proteasa recombinante NS3/4A, mediante péptidos de transferencia de energía de ondas amplias de excitación/emisión.

Resultados

Los autores demostraron en estudios previos que la inducción de la HO-1 con hemo implica una menor replicación del VHC in vitro; sin embargo, no se pudo saber si las concentraciones fisiológicas de hemo ejercen efectos antivirales. La incubación de los replicones con diversas cantidades de hemo demostró la existencia de un efecto antiviral dependiente de la concentración, visible a niveles tan bajos como 5 µM, que se encuentran dentro del intervalo de concentración del grupo hemo en la sangre periférica humana (10-16 µM).

La BV presentó una actividad antiviral a partir de la concentración de 20 µM. Los autores lo contrastaron con la BR IX-alfa y la mezcla de isómeros de BR, cuyas concentraciones necesarias para suprimir la replicación del VHC fueron considerablemente mayores (200 µM). Para poder comparar con la realidad, 20 µM de BV o BR corresponden a un nivel de BR circulante de 1.4 mg/dl, aproximadamente. Los análisis de Western blot confirmaron una disminución de NS5A en ambas líneas de replicones luego del tratamiento con BV o BR. También, se redujeron los niveles de la proteína del core, lo que concuerda con la menor replicación del VHC. El tratamiento con BV disminuyó NS5A de manera dependiente de la dosis, según el ensayo con Western blot o inmunoprecipitación con el anticuerpo específico contra NS5A. De acuerdo con los informes previos, el FeCl2 también redujo NS5A y la proteína del core, así como disminuyó el ARN del VHC. Al evaluar los efectos de la BV (20-200 µM) sobre la infección por VHC en las células Huh7.5 con el clon J6/JFH se observó una marcada disminución de la infección por este clon, sobre la base de la inmunorreactividad del VHC en diversos sueros polivalentes y la medición del ARN viral.

Teniendo en cuenta que la proliferación celular y la toxicidad afectan profundamente la expresión del ARN y las proteínas del VHC en los replicones, los autores evaluaron si la BV influyó sobre el ciclo celular o si fue tóxico en las condiciones del ensayo. No se observaron efectos de la BV o la BR sobre la proliferación celular ni toxicidad al incubar las células con tetrapirrol en un medio con 5% o 10% de suero fetal bovino.

Un ensayo evaluó los efectos de la BV y la BR sobre la proteasa NS3/4A recombinante; se vio que la BV ejerció una inhibición más potente que la BR y, además, presentó el mayor valor de la mediana de las concentraciones inhibitorias mínimas (9.3 µM) que cualquier otro tetrapirrol probado. También se realizó una modificación del ensayo de fluorescencia con la proteasa, en la cual se usó la proteasa endógena preparada a partir del replicón en lugar de la proteasa recombinante. En ambos casos los resultados fueron similares, si bien la inhibición de la proteasa endógena requirió concentraciones ligeramente mayores de BV que la recombinante. Los datos de la cinética de la inhibición de la proteasa NS3/4A evaluada por el gráfico de Lineweaver-Burk demostraron que la BV inhibe esta proteasa de forma competitiva.

El Western blot preliminar demostró que la eliminación de la expresión de la BVR fue altamente eficaz y llevó a una reducción del 80% en la expresión de BVR en ambas líneas de replicones. La actividad antiviral de la BV fue estimulada de forma significativa por esta intervención en comparación con el grupo control con eliminación de ARN. En cambio, la eliminación de la BVR no potenció de forma significativa el efecto antiviral de la BR en los replicones incubados con este tetrapirrol.

Al evaluar los efectos de la BV sobre la actividad antiviral del interferón alfa, se observó que hubo un efecto aditivo evidente. Según los autores, estos resultados indican que la BV no compromete la acción del interferón, sino que más bien la potencia.

Discusión

La hemoxigenasa cataliza la conversión del grupo hemo a cantidades equimolares de BV, hierro y monóxido de carbono. La expresión de la isoenzima inducible HO-1 aumenta frente a agentes estresantes tales como hipoxia, shock térmico, metales pesados y oxidantes. Los autores del presente estudio demostraron, al igual que otros, que la expresión de HO-1 está reducida en el hígado infectado con el VHC y altamente modulado en algunos modelos virales in vitro. Aun más, en los modelos de cultivos celulares del VHC la HO-1 modula tanto el estrés oxidativo como la replicación del virus.

Para evaluar los mecanismos por los cuales el hemo exógeno o la sobrexpresión de HO-1 inhiben la replicación del VHC en los cultivos, se estudió el efecto antiviral de los productos de oxidación del hemo. Así como ya hay dos informes que demuestran la inhibición de la replicación del VHC por parte del hierro, el presente estudio demostró que la BV tiene una actividad antiviral potente contra el VHC en dos líneas separadas de replicones y que también inhibe la replicación del clon J6/JFH en las células Huh7.5. Más importante aún fue encontrar datos de que la BV es un inhibidor potente de la proteasa NS3/4A. Un estudio reciente informó que la BV no solo presentó actividad antiviral en los replicones, sino que además se vio un aumento en los productos de los genes estimulados específicamente por interferón, por lo que los autores proponen que este efecto a nivel genómico es un resultado directo de la inactivación de la proteasa NS3/4A por la BV.

Se ha demostrado también que el hierro inhibe la replicación del VHC mediante la prevención de la unión por cationes divalentes a la ARN polimerasa dependiente de ARN. Los resultados de este trabajo demostraron que el FeCl2 inhibe la replicación, lo que, sumado a los datos anteriores, demuestra que la oxidación del hemo por la HO-1 libera dos agentes antivirales: hierro y BV. Este hecho subyace a la reducida expresión de HO-1 en el hígado humano infectado por el VHC y, dado que la actividad antiviral del hemo es evidente a concentraciones fisiológicas en el suero, se sostiene la posibilidad de usar BV o hemo como compuestos antivirales específicos. El hemo está comercialmente disponible como hemina para el tratamiento de las porfirias y, si bien no se ha valorado la actividad antiviral in vivo, estos compuestos parecen ser seguros.

Conclusión

Los autores concluyen que la BV es un agente antiviral potente, probablemente como consecuencia de su habilidad para inhibir la proteasa NS3/4A. Los resultados sugieren que el hemo, la BV o sus derivados relacionados podrían ser útiles para las futuras terapias con fármacos que actúen a nivel de la proteasa NS3/4A.

Especialidad: Bibliografía - Infectología